辣椒疫霉菌拮抗細菌的篩選、鑒定及防效測定

孫冰冰，段紅英，李偉，魏軍，田濤*

(1.天津市農業科學院植物保護研究所，天津 300381;2.天津市西青區植物保護站，天津 300380)

辣椒疫病，是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一種毀滅性的土傳病害，在全球范圍內的熱帶、亞熱帶及溫帶地區的露地和保護地均有發生［1－2］。我國自從50年代在江蘇報道此病的發生后，其發生和為害有逐漸加重的趨勢，常導致植株成片死亡，發病地塊一般病株率為20%左右，嚴重的達到80%以上［3］。目前尚無對辣椒疫病有效防治的抗病品種，生產上防治主要是以化學藥劑為主。但由于長期大量使用殺菌劑，P.capsici已對大多數常用農藥品種產生了不同程度的抗藥性［4］。另外，由于土壤吸附和微生物降解作用，使用化學農藥防治辣椒疫病效果不佳。由于該病的循環周期非常短(僅3～5 d)，病害的傳播速度也非常快。這些原因造成生產中化學農藥的大量、高頻使用，帶來嚴重的環境和農產品中農藥殘留問題［5］。

由于利用自然界有益微生物防治土傳病害具有安全性和有效性方面所具有的天然優勢，因此利用有益微生物對辣椒疫病進行生物防治成為重要的研究方向。我國已報道的生防菌主要有芽孢桿菌、放線菌、木霉、曲霉等［1－3，5－8］。國外有 Quantum 4000、BIBAB－T、AmniteA－100、Biologic－SC27 等細菌類和真菌類生防產品作為殺菌劑或生物肥料注冊登記［5］。本研究中，利用了單一靶標初篩－多靶標復篩－室內生測的篩選體系從來自全國多個地區的根際土壤中篩選出對辣椒疫病防病效果達到70%以上的6個候選生防菌株，其中TB1340防效達到82%。結合16S rRNA基因序列測序鑒定和形態學觀察，TB1340被初步鑒定為Bacillus sp.。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養基及辣椒品種

辣椒疫霉(Phytophtora capsici)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)及瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)為天津市植物保護研究所植物病害生物防治研究室保存。

LB培養基用于拮抗細菌的分離培養。PDA培養基用于4種病原菌的培養以及拮抗細菌的篩選。幾丁質培養基(膠狀幾丁質 15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.3 g、瓊脂20 g，定容至1000mL，pH值7.0～7.2)用于幾丁質酶的檢測。纖維素酶培養基(蛋白胨10 g，酵母粉5 g，羧甲基纖維素鈉10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，瓊脂20 g，定容至1000mL，pH 值 7.0)用于纖維素酶的檢測。β－1，3－葡聚糖酶培養基(蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 5 g，剛果紅 0.04g，瓊脂 20 g，定容至 1000mL，pH 值7.0)

供試辣椒品種:紅線椒8819(對辣椒疫病中等抗性)，天津科潤種業有限公司提供。

1.2 拮抗細菌的分離、純化與保存

從天津、河北、山東、山西、福建、河南及江蘇等全國多個地區采集土樣56份(選取植物根圍1～2 mm土壤)，采用土壤稀釋法于LB培養基上分離培養細菌，選擇合適的稀釋濃度(每個平皿出現大約200個菌落)。從每個平皿上選擇10個左右菌落形態有差異的菌株經平板劃線純化，轉移到加20%甘油的EP管里面，－20℃保存。

1.3 拮抗細菌的篩選

采用平板對峙法，用直徑7 mm的打孔器取生長旺盛的病原菌菌餅轉接于PDA平板中央，視病原真菌生長速度選擇合適時期接種分離到的細菌(腐霉和立枯絲核菌與細菌同時接種，疫霉和灰霉待菌絲擴增1 cm后再接種待測細菌)。接種時用高溫滅菌的牙簽蘸取分離到的細菌，等距離(距離病原菌3 cm處)對稱點接到PDA平板上，于25℃恒溫培養，待對照皿中真菌菌絲即將長滿皿時測量抑菌圈大小，根據抑菌圈大小篩選出對病原菌具有較強拮抗作用的菌株。

1.4 室內防治效果測定

選擇大小均勻的辣椒種子經消毒后，用滅菌水浸泡4 h，于28℃催芽播種至露白。然后用含有1.0×108cfu/mL待測菌懸液浸種45 min。將4粒種子放入裝有滅菌土的營養缽里，待幼苗長至3～4葉期時留兩株長勢均勻的幼苗，每個處理20盆，3次重復。將病原菌P.capsici用CA培養基在25℃培養10 d后，誘導出游動孢子，用無菌水將游動孢子濃度調整為1.0×105cfu/mL。在距離植株3 cm處將5mL游動孢子懸浮液注入植株根部。置于28℃光照培養箱培養，分別于7、14、21 d后調查植株萎蔫或死苗情況(病株數)［9］。

1.5 菌株生物學特性測定

幾丁質酶活性檢測:將待測菌株接種在含有膠體幾丁質的幾丁質酶檢測培養基［10］上，經37℃過夜培養后，在4℃放置7 d后檢測菌落邊緣形成的透明圈寬度。纖維素酶活性檢測:將待測菌株接種在含有羧甲基纖維素鈉的纖維素酶檢測培養基［11］上，經37℃過夜培養后，在25℃放置1 d后經染色處理，觀測在菌落邊緣是否形成透明圈及其寬度。β－1，3－葡聚糖酶活性檢測:將待測菌株接種在含有剛果紅的葡聚糖酶檢測培養基［12］上，經37℃過夜培養后，在25℃放置1 d后，觀察菌落周圍的培養基顏色變化。

1.6 菌株分類地位的16S rRNA序列測定

按常規小量細菌基因組提取方法提取制備樣品［13］，根據細菌16S rRNA基因序列的保守區域設計引物:16sF－AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT 和 16sR－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC。 把 用PCR擴增得到的片段連接到 pUC－T載體(康為世紀)，轉化大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株，篩選陽性轉化子，送金唯智生物科技公司進行序列測定。將得到的序列與其他細菌來源的16S rRNA基因序列進行比對(MEGA)，分析其親緣關系。

1.7 數據處理

利用DPS軟件中的Duncan′s新復極差法進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 生防菌的分離與初步篩選

依照材料與方法所述，從來源于全國各地的56份樣品中分離菌株，建成庫容為10000株的菌株資源庫。以P.capsici為靶標進行平板拮抗實驗，初步得到802株對P.capsici具有拮抗作用的生防菌候選菌株，其抑菌圈寬度為2～16 mm。用初篩得到的菌株對R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum進行平板拮抗試驗，得到62株對4種病原真菌均具有較好拮抗作用或對3種具有很強拮抗作用的候選生防菌株(表1)，命名為 TB－1301 ～TB－1362。

表1 候選生防菌株對4種植物病原真菌的拮抗能力測定Table 1 Antagonistic capability determination of biocontrol candidates against four kinds of phytopathogenic fungi

續表1

2.2 室內盆栽測定對辣椒疫病防治效果

從62株候選生防菌中挑選出對4種病原菌均具有良好拮抗效果的29個菌株進行室內盆栽試驗，以測定其對辣椒疫病的防治效果。在接種病原菌后7、14和21 d調查植株發病情況，結果表明在既不接種病原菌也不接種生防菌的處理中(CK1)，沒有植株發病;在只接病原菌，不接種生防菌的處理中(CK2)，植株全部發病;在同時接種病原菌和生防菌的各個處理與CK2相比，其發病率均在不同程度表現出下降的趨勢，在21 d后菌株TB1307、TB1308、TB1314、TB1340、TB1344和TB1358相對防治效率仍達到70%以上，其中菌株TB1340防效最好，在接種病原菌后7、14和21 d調查，其相對防效分別為100%、90%和82%(表2)。

表2 拮抗菌株對辣椒疫病盆栽的防治效果Table 2 Control effects of antagonistic strain against pepper phytophthora blight in pot experiment

續表2

2.3 菌株TB1340基本生物學特性

菌株TB1340在LB固體培養基上經37℃培養16 h后，經肉眼觀察其菌落為圓形，中間稍微隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，呈白色半透明狀(圖1A);將菌株TB1340接種在含有膠體幾丁質的幾丁質酶檢測培養基上，經37℃過夜培養后，在4℃放置7 d后在菌落邊緣形成寬度約3 mm的透明圈(圖1B);將菌株TB1340接種在含有羧甲基纖維素鈉的纖維素酶檢測培養基上，經37℃過夜培養后，在25℃放置1 d后經染色處理，在菌落邊緣觀測到寬度約20mm的透明圈(圖1C);將菌株TB1340接種在含有剛果紅的葡聚糖酶檢測培養基上，經37℃過夜培養后，在25℃放置1 d后，在菌落周圍的培養基顏色明顯變淺(圖1D);

圖1 菌株TB1340基本生物學特性Fig.1 The basic biological characteristics of strain TB1340

2.4 菌株TB1340種屬16S rRNA基因序列測定

將菌株TB1340提取基因組DNA后，擴增其16S rRNA基因序列，測序并將TB1340的16S rRNA基因序列上傳 GenBank，其 GenBank登錄號為 KJ501094。序列比對分析表明，該菌和解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens菌株Hk8－20以及枯草芽孢桿菌B.subtilis菌株CZB13同源性最高，達到97.89%。另外，與菌株甲基營養型芽孢桿菌B.methylotrophicus相比其同源性也達到97.08%。將菌株TB1340的16S rRNA基因序列與高同源性的B.amyloliquefaciens、B.subtilis的序列以及花域芽孢桿菌B.vallismortis、魯菲不動桿菌Acinetobacter lwoffii、蠟樣芽孢桿菌B.cereus等菌株的序列比對，構建系統發育樹(圖2)。菌株TB1340與12株B.amyloliquefaciens、3株 B.subtilis及2株B.methylotrophicus聚在一起形成1個分支。結合菌株TB1340的16S rRNA基因序列測定和其形態特征(圖1A)，將其確定為Bacillus sp.，但最終分類地位仍需進一步生理生化驗證。

圖2 菌株TB1340的16S rRNA區域的進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of 16S rRNA area of strain TB1340

3 討論

我國幅員遼闊，不同的地方氣候條件和地形地貌差異較大，造就了豐富的微生物資源。如何更好地開發和利用自然界中的有益微生物防治植物病害是一個重要的科學問題。為了更為高效地篩選植物病害生物防治菌株，科研工作者進行了多種嘗試。有研究者利用分子生物學和生物化學手段建立高通量的篩選體系［14－16］;有研究者采取從沙漠、高原、極地和灘涂篩選生防菌株的策略［2，11，16］。在本研究中，為了發掘我國的微生物資源，并且從微生物和植物互作的角度考慮，采用了從多個省份選取長勢較好的農作物根圍分離和篩選生防菌株的策略，建立了庫容為10000株的微生物資源庫。以P.capsici為靶標，利用平板拮抗的方法從中篩選出802株對P.capsici具有較好拮抗效果的菌株。

與化學藥劑相比，植病生防產品在防治范圍上較窄，這是影響植物病害生物防治產品推廣的一個限制性因素。為了盡可能地獲得較為廣譜的候選生防菌株，同時出于減少在防病效果生物學測定的工作量考慮，又以R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum為靶標對候選生防菌株的拮抗能力進行檢測，確定了62株對4種病原真菌具有較強拮抗能力或對3種真菌具有很強拮抗能力的菌株。經溫室盆栽實驗測定，有6株候選菌株防效達到70%以上，其中TB1340菌株防效達到82%，表現出良好的應用前景，但是其田間使用效果以及對其他病害的防治效果尚需進一步地驗證。

生防菌所產生的抗生素類、脂肽類、幾丁質酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶等物質是其抑菌和防病的關鍵因子［10，17］，幾丁質酶、纖維素酶和 β－1，3 葡聚糖酶是多種芽孢桿菌類生防菌株的關鍵生防因子［10，12］。用幾丁質酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶鑒別培養基檢測菌株TB1340產酶情況時，發現其產生這3種酶的能力都比較強(圖1)。將菌株TB1340產酶能力和其廣譜的抑菌能力相聯系，我們進一步思考:(1)如何將幾丁質酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶作為指標，納入科學的篩選評價體系從而提高生防菌的篩選效率;(2)這3種酶對菌株TB1340針對不同的病原真菌的拮抗和生防能力的貢獻是否相同，如果不同，這種差異具有怎樣的普遍規律。這些有待于進行更加深入地研究。

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