拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2及其制劑對葡萄霜霉病的防效測定

扈進冬，吳遠征，李紀順，魏艷麗，陳泉，楊合同，2

(1.山東省科學院生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014;2.山東理工大學生命科學學院，山東 淄博 255049)

葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的一種在世界范圍內影響葡萄種植的重要病害，嚴重危害葡萄的葉片和嫩梢，影響葡萄生長和產量。目前防治霜霉病所用藥劑大都是人工合成化學農藥，如安泰生可濕性粉劑、甲霜靈錳鋅、霜疫必克、瑞毒霉、霜霉威和烯酰嗎啉等等。生物防治可以利用有益微生物和其代謝產物對植物病害進行有效的防治，近些年來，在國家的大力支持和鼓勵下，已有多種生防菌劑在國內得到廣泛應用。［1－3］

拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2是山東省科學院生物研究所新近從發生黃瓜霜霉病的蔬菜大棚中篩選的一株生防菌，對多種病原真菌均具有良好的拮抗作用，是一株廣譜拮抗菌，經鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，對其抗菌物質進行分離純化，分析為多肽類抗菌物質。此外，該菌株還胞外分泌β-1，3-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶和蛋白酶等胞壁降解酶，通過葉盤漂浮法的室內測定發現其對葡萄霜霉病菌有較好的防治效果。本文通過田間試驗初步研究了拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2在大田環境下對葡萄霜霉病的防治效果，為進一步開發利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2、LTR-2為本實驗室保存木霉生防菌株，對多種真菌病害均有良好的防治效果;受試葡萄品種為“玫瑰香”。拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2保存采用改良的NA培養基:牛肉膏4.0 g/L，蛋白胨11.0 g/L，氯化鈉0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH值為7.0。拮抗性多粘類芽孢桿菌發酵液:豆餅粉5%，玉米粉2%，碳酸鈣0.1%，硫酸鎂0.05%，硫酸銨0.2%，pH值為7.0。LTR-2發酵選用PDA培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 PB-2及其無菌濾液對葡萄霜霉病菌抑制作用

因葡萄霜霉病菌只能活體培養，故采用葉盤漂浮法［4－5］測定PB-2對葡萄霜霉病菌的室內抑制活性。試驗設6個處理:PB-2改良的NA發酵液(30℃，120 r/min培養36 h，菌體含量2.3×109cfu/mL)無菌水稀釋成菌體含量106、107、108cfu/mL，過0.22 μm濾膜的PB-2發酵液，72%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑(江蘇寶靈化工股份有限公司)600倍稀釋液，無菌水對照。從山東省科學院東區葡萄試驗田采集發病葉片和新梢第4～6輪未發病葉片(感病品種“玫瑰香”)。用無菌水洗下發病葉片的病菌孢子囊，配成霜霉病孢子懸浮液(孢子囊濃度控制為106cfu/mL)，4℃下存放備用。準備培養皿若干，內置不同處理溶液潤濕的濾紙，用打孔器在未發病葉片的葉脈間打孔制成直徑1 cm的葉盤，分別置于這些含有不同藥液處理的5 cm培養皿中，每處理重復3次，每皿加3片葉盤，葉背面朝上分別擺放于藥液潤濕的吸水紙上，將配制好的孢子囊懸浮液10 μL接種于葉盤中央。置于人工氣候室中，22℃下培養，7 d后觀察結果。根據病斑面積占葉盤面積的百分比劃分病級，0級:無病斑;1級:1% ～20%;2級:21% ～50%;3級:＞50%。計算病情指數和抑制率。

1.2.2 PB-2 的田間藥效試驗

首先制備PB-2可濕性粉劑，先將PB-2改良的NA發酵液(菌體含量2.3×109cfu/mL)與填料麥飯石(200目)按比例吸附混合至活菌體數109cfu/g，添入黃原膠(0.5%)、十二烷基磺酸鈉(0.25%)和羧甲基纖維素(5%)混合均勻，自然晾干制得拮抗性多粘類芽胞桿菌PB-2可濕性粉劑。LTR-2(木霉)可濕性粉劑(中試產品，含2×108cfu/g木霉活孢子)

試驗地點選在山東省科學院東區葡萄試驗田內進行，品種為“玫瑰香”(感病品種)，常規栽培措施管理。試驗按農業部藥檢所田間試驗準則設計［6－7］。共7個處理:PB-2可濕性粉劑用清水稀釋50、100、200倍，LTR-2(木霉)可濕性粉劑用清水稀釋50、100、200倍，清水對照。采用噴霧法施藥，在16:00后進行，避開高溫時間。每處理3株，重復3次，隨機區組設計。重點噴施葉背，均勻噴施，以少量滴水為度。分別于施藥后1周、2周2次隨機選取每處理上、中、下部位100片葉調查病葉率、病情指數和相對防治效果。病情分級標準和病情指數計算方法按照國家公益性行業(農業)科研專項“果樹霜霉病防控技術研究與示范”進行，葡萄霜霉病在葉片上的分級標準:0級:無病斑;1級:病斑面積占整個葉面積的5%以下;3級:病斑面積占整個葉面積的6% ～25%;5級:病斑面積占整個葉面積的26% ～50%;7級:病斑面積占整個葉面積的51% ～75%;9級:病斑面積占整個葉面積的75%以上。病情指數=［∑(各級病葉數×相對級數值)/(調查總葉數×9)］×100。

2 結果與分析

2.1 PB-2發酵液對葡萄霜霉病菌的室內抑制活性

從表1中可看出，菌含量為108cfu/mL的PB-2發酵稀釋液對葡萄霜霉病菌抑制率達到了77.22%，與對照藥劑72%(質量分數)甲霜靈錳鋅可濕性粉劑600倍稀釋液的抑制率(81.61%)相當，顯著優于其他處理;PB-2無菌濾液的抑制率(60.23%)與PB-2發酵液菌體含量107cfu/mL的抑制率(63.34%)無顯著差異;菌含量為106cfu/mL的PB-2發酵稀釋液的抑制率(53.16%)最低，顯著低于其他處理。

表1 PB-2發酵液對葡萄霜霉病菌的室內抑制活性Table 1 Indoor inhibition activity of PB-2 fermentation broth against Plasmopara uiticola

2.2 PB-2可濕性粉劑對葡萄霜霉病的田間藥效

由表2可知，PB-2可濕性粉劑的50、100倍稀釋液對葡萄霜霉病具有較好的防治效果，施藥后1周相對防效分別為46.91%和36.99%，2周后分別為46.44%和42.10%。LTR-2可濕性粉劑50倍稀釋液在1周后防效為33.81%，對葡萄霜霉病也有一定的防效，但持續性差，2周后防效不明顯，試驗未發現PB-2可濕性粉劑稀釋液對植株和果實有不良影響。

表2 PB-2可濕性粉劑對葡萄霜霉病的田間藥效Table 2 Field control efficacy of PB-2 wettable powder against grape downy mildew

3 討論

多粘類芽胞桿菌作為生防菌已有大量的研究報道，已發現其對終極腐霉菌(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)以及番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum)等多種病原真菌具有明顯的抑制作用。但用于葡萄霜霉病的研究還較少，田間實際應用并有較好穩定防效的則更是鮮有報道［8］。本試驗室篩選到的拮抗菌PB-2無論在室內還是在田間，對葡萄霜霉病均具有較好的防效，有希望開發成為一種可有效防治葡萄霜霉病的生防制劑。目前我們已初步開發成了制劑，進一步的田間防效試驗也正在進行當中，結果將在后續的文章中予以報道。

葡萄霜霉病是田間比較難防治的一種病害，PB-2可以較好防治葡萄霜霉病主要原因可能是:PB-2產生多肽類抗菌物質且性質比較穩定，胞外分泌多種胞壁降解酶，如具有較高的β-1，3-葡聚糖酶等纖維素酶類活性［9］，而葡萄霜霉病菌作為一種低等真菌其細胞壁以纖維素為主，PB-2胞外分泌的纖維素降解酶類可以破壞其細胞壁，從而抑制其生長。實驗室生測和田間試驗結果表明，多粘類芽孢桿菌PB-2具有潛在的開發應用前景。

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