Alcalase 2.4L堿性內切酶和Flavourzyme風味酶酶解大豆分離蛋白及脫苦工藝優化

孫 勇

（北京市食品研究所，北京 100162）

大豆中含有豐富的蛋白質及近20種氨基酸，其中含有人體必需氨基酸，營養豐富，不含膽固醇，與乳、肉和雞蛋等動物蛋白相比，大豆蛋白具有較強的價格優勢[1]。但大豆蛋白質分子結構復雜，相對分子質量較大，溶解性差，消化率和生物效價不及牛乳等動物蛋白質[2]。通過生物酶解可以使大豆蛋白這些性質得到改善[3]，酶解產物大豆肽比蛋白質更易于被人體消化和吸收[4]，且大豆肽具有降血脂[5]、降血壓[6]、抗氧化[7]、提高機體免疫力[8]等生物活性作用，從而進一步拓展了大豆蛋白在食品工業中的應用[9]。同化學改性相比，酶法改性具有酶解條件溫和、功能性質可控等優點。生物酶改性作為大豆蛋白改性的一種新興、無毒副作用、安全的改性方式，具有很重要的研究開發意義。

近年來利用酶法對大豆蛋白的研究較多。錢方等[10-11]對蛋白酶及其大豆蛋白水解物苦味的研究，得出胃蛋白酶和Alcalase堿性內切酶較易產生苦味，并對大豆苦味肽進行了研究，得到苦味肽粗品。但采用多種酶對大豆蛋白水解液脫苦效果研究尚鮮有報道。本研究擬采用Alcalase 2.4L堿性內切酶和Flavourzyme風味蛋白酶對大豆分離蛋白的水解及脫苦的反應進行研究和條件優化，采用單因素和正交試驗確定最佳酶解條件，為工業化生產功能性大豆多肽提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：山東禹王集團；福林試劑：上海荔達生物科技有限公司；硼砂：山東黃河龍生物有限公司；三氯醋酸、碳酸鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；酪氨酸：國藥集團化學試劑有限公司；奎寧：北京化學試劑公司；Alcalase堿性內切蛋白酶、Flavourzyme風味蛋白酶（食用級）：丹麥諾維信公司。

1.2 儀器與設備

ES-300E電子天平、UV-6000分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：北京市長風儀器儀表公司；PH/ORP-1001 pH計：上海三本環保科技有限公司；HJ-4恒溫攪拌器：海門市麒麟醫用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白預處理

按一定底物濃度配比準確稱取大豆分離蛋白，配成所需濃度的大豆蛋白溶液，然后在90 ℃水浴加熱10 min，使蛋白質適度變性，以易于酶解的進行，取出冷卻至室溫，放入恒溫攪拌器。

1.3.2 酶活力測定

福林酚試劑在堿性條件下極不穩定，易被酚類化合物還原而呈藍色反應[12]。由于蛋白質中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質及其水解產物也呈藍色反應。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應，來間接測定蛋白酶的活力。經測定Alcalase堿性內切蛋白酶活力為183 100 U/mL，Flavourzyme風味蛋白酶活力為25 600 U/g。

1.3.3 水解度的測定

蛋白質的水解度（degree of hydrolysis，DH）是指蛋白質水解反應過程中被裂解的肽鍵的百分數。在堿性條件下采用pH-Stat法[13]。計算公式如下：

式中：DH為水解度，%；B為消耗堿量，mL；N為NaOH 摩爾濃度，mol/L；α為大豆蛋白氨基的平均解離度，當pH值為7時，α=0.44；m為水解液中蛋白質的總質量，g；h為每克蛋白質底物具有的肽鍵毫摩爾數，mmol/g，對于大豆分離蛋白h=7.75 mmol/g。

1.3.4 Alcalase 2.4L堿性內切酶酶解反應

1.3.4.1 單因素試驗

配制一定濃度大豆蛋白混合液預處理后，隨著水解的進行，酶解液pH值逐漸下降，滴加0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值為8.0，記錄1 h內消耗堿量與時間關系，換算成DH值與時間關系，繪制成圖，確定最佳加酶量[14]。固定其他條件，分別改變加酶量、底物濃度、溫度、pH值等單一條件，考察Alcalase 2.4L堿性內切酶對大豆蛋白水解度的變化情況。加酶量條件：底物質量分數5%，酶解溫度60 ℃，酶解pH 8.0，加酶量按酶和底物之比為2 000 U/g、5 000 U/g、8 000 U/g、11 000 U/g、14 000 U/g。底物質量分數條件：酶解溫度60 ℃、酶解pH 8.0、加酶量10 000 U/g 條件下，底物質量分數為1%、3%、5%、7%、9%。酶解溫度條件：底物質量分數5%、酶解pH8.0、加酶量10 000 U/g，酶解溫度為50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃。酶解pH值條件：底物質量分數5%、酶解溫度60 ℃、加酶量10 000 U/g條件下，酶解pH值為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.4.2 Alcalase酶解條件優化正交試驗

Alcalase蛋白酶酶解大豆分離蛋白的最佳條件的確定采用L9（34）正交設計，以水解度（DH）為測定指標，考察4個因素對水解度的影響，水解時間為1 h。根據最佳單因素試驗結果分析，選擇底物質量分數、水解溫度、pH值、加酶量進行4因素3水平的正交試驗。正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 Alcalase酶解條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing enzymatic hydrolysis by Alcalase

1.3.5 苦味值的測定

以奎寧為基準物質，配制標準液。經評定當奎寧標準液濃度為c=3×10-6mol/L時，剛好無苦味，定c濃度為下限，32c濃度為上限（若再增加奎寧濃度，苦味基本不再增加），在c～32c之間，隨著奎寧濃度增加，苦味值也相應增加。設定苦味值的評分標準見表2[15]。

表2 苦味值的評分標準Table 2 Evaluation scores of bitterness value

評定小組由5人組成，評定員用蒸餾水漱口后，用一次性吸管取待評定液2～3 mL置于口中，10 s后吐出，漱口，取苦味程度相近的標準液品嘗，確認兩苦味是否相近，若相近即可將待評定液的苦味值定為該標準液的苦味值，否則需取其他標準液再嘗，直至確定苦味值。結果取5人平均評定值[16]。

1.3.6 Flavourzyme風味蛋白酶酶解反應

（1）單因素試驗

對經過Alcalase 2.4L堿性內切酶水解后的水解液進行4 h水解，根據苦味評分標準進行評分。固定其他條件，分別改變加酶量、溫度、pH值、酶解時間等單一條件，考察Flavourzyme風味蛋白酶對大豆蛋白的水解液苦味值的變化情況。加酶量酶解pH 7，酶解溫度50 ℃，酶解時間4 h，加酶量分別為100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g、300 U/g。酶解溫度：酶解pH 7，加酶量250 U/g，酶解時間4 h，酶解溫度分別為45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃。酶解pH值：酶解溫度50 ℃，加酶量250 U/g，酶解時間4 h，酶解pH值分別為5、6、7、8、9。酶解時間：酶解pH 7，酶解溫度50 ℃，加酶量250 U/g，酶解時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

（2）Flavourzyme風味蛋白酶脫苦工藝優化正交試驗

Flavourzyme風味蛋白酶酶解大豆分離蛋白的最佳脫苦條件的確定采用L9（34）正交設計，以苦味值為評價指標，考察酶解溫度、酶解pH值、加酶量、反應時間4個因素對水解液苦味評分的影響。正交試驗因素與水平如表3所示。

表3 Flavourzyme風味蛋白酶脫苦工藝優化正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing debittering process by Flavourzyme

2 結果與分析

2.1 Alcalase 2.4L酶酶解單因素試驗結果

Alcalase 2.4L酶解單因素試驗結果見圖1。由圖1A可看出，Alcalase 2.4L酶解實驗過程中隨著加酶量的增加，水解度顯著增加，但當加酶量＞11 000 U/g后，水解速度減慢，曲線趨于水平，因此考慮酶解效果，Alcalase 2.4L酶加酶量為11 000 U/g時較為適宜。

如圖1B所示，在底物質量分數較低時，大豆分離蛋白的水解度較高，當底物質量分數增加，水解度出現下降趨勢，原因可能是由于大豆分離蛋白溶解度不高，當底物質量分數過高時會造成水解液黏度增大，影響蛋白酶的擴散，從而抑制水解反應的進行。因此，考慮到酶解效率和生產成本，底物質量分數在3%～5%較為適宜。

由圖1C可看出，酶解溫度為50～60 ℃時，水解度隨溫度的升高而增大；但溫度＞65 ℃后，水解度迅速下降。因此，Alcalase 2.4L蛋白酶酶解大豆分離蛋白的最適溫度為55～65 ℃。

如圖1D所示，Alcalase 2.4L蛋白酶在pH 7.5～8.5 時對大豆分離蛋白的水解能力較強。

2.2 Alcalase 2.4L酶酶解條件優化正交試驗結果

由表4極差分析可知，各因素影響效果主次關系為C＞A＞D＞B，即pH值＞加酶量＞底物質量分數＞溫度，同時，得出最優組合為C3A3D2B2，即加酶量14 000 U/g、酶解溫度60 ℃、酶解pH 8.5、底物質量分數5%。在此最佳條件下進行驗證試驗，水解1 h的水解度為41.95%。

圖1 Alcalase 2.4L酶加酶量(A)、底物質量分數(B)、酶解溫度(C)及酶解pH值(D)對大豆分離蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of Alcalase 2.4L addition (A),substrate concentration(B),hydrolysis temperature (C) and hydrolysis pH (D) on hydrolysis degree of SPI

2.3 酶解反應時間對酶解度的影響

由圖2可知，Alcalase 2.4L蛋白酶在120 min時水解度最高，可達45.34%，此時水解液為清澈透明的淺黃色液體，僅有少量沉淀。繼續延長反應時間，水解度增長趨勢不明顯，因此最佳水解時間應為2h。

表4 Alcalase 2.4L酶酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing enzymatic hydrolysis by Alcalase

圖2 酶解反應時間對水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree of SPI

2.4 苦味分值測定

大豆蛋白經酶解后往往會產生一種令人難以接受的苦味，會影響其在食品中的應用，因此本實驗評價了在最佳酶解條件下的酶解液的苦味值。由五位評定員品嘗并打分后得出結論，在最佳酶解條件下（加酶量14 000 U/g，酶解溫度60 ℃，酶解pH 值為8.5，底物質量分數5%，酶解時間2 h），Alcalase 2.4L蛋白酶水解液苦味評分為4。

2.5 Flavourzyme風味蛋白酶酶解單因素試驗結果

Flavourzyme風味蛋白酶酶解單因素試驗結果見圖3。由圖3A可以看出，隨著酶添加量的增大，大豆分離蛋白酶水解產物苦味評分逐步降低，即苦味逐漸變小，當酶用量＞250 U/g時苦味幾乎不變。這主要是由于風味酶是以疏水性專一的外切蛋白酶為主，水解后使疏水性氨基酸較多地位于多肽的末端或從游離出來，從而苦味較低。

圖3 Flavourzyme酶加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH值(C)及酶解時間(D)對大豆分離蛋白苦味分值的影響Fig.3 Effect of Flavourzyme addition (A),hydrolysis temperature (B),hydrolysis pH (C) and hydrolysis time (D) on bitterness value of SPI

由圖3B可以看出，隨反應溫度升高，酶解液苦味評分下降，在50～60 ℃時苦味最小。繼續升高溫度，苦味評分反而略有增大。這是因為Flavourzyme風味蛋白酶的最適溫度在50 ℃左右，溫度太低，酶活性達不到最高。而溫度過高時，對Flavourzyme風味蛋白酶的活性有抑制作用，使其達不到最佳酶解效果。

由圖3C可以看出，pH值5.0～7.0階段，苦味評分逐漸減小為1.4，而pH值由7.0升至8.0時，苦味評分又逐漸增大，從而確定適宜pH值為7.0左右。

由圖3D可以看出，隨水解的進行，苦味評分逐漸降低，在4 h時苦味最小，4～5 h時苦味幾乎不再變化，因此適宜酶解時間范圍確定在3～5 h。

2.6 Flavourzyme風味蛋白酶脫苦工藝優化正交試驗結果

表5 Flavourzyme酶脫苦工藝優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing debitterizing process by Flavourzyme

由表5極差分析可知，各因素影響苦味評分的主次關系為D＞A＞B＞C，即加酶量＞酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時間，同時，得出最佳脫苦工藝條件為A2B2C1D3，即加酶量300 U/g、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時間3 h。在此最佳條件下進行驗證試驗，苦味值為1.2，水解液幾乎無苦味，脫苦效果理想。

3 結論

本試驗研究了以Alcalase 2.4L堿性內切酶水解大豆分離蛋白制備大豆肽的工藝，同時通過加入Flavourzyme風味蛋白酶改善酶解液苦味。通過單因素和正交試驗得到了Alcalase 2.4L堿性內切酶和Flavourzyme風味蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳水解工藝，使水解度得到較大提高的同時也解決了水解液的苦味問題。結果表明，Alcalase 2.4L堿性內切酶酶解最優條件是：酶解pH 8.5、酶解溫度60 ℃、底物質量分數5%、加酶量為14 000 U/g，酶解時間2 h，水解度可達45.34%，水解液苦味值為4；繼續加入Flavourzyme風味蛋白酶反應，水解液苦味值大大降低。試驗證明，Flavourzyme風味蛋白酶脫苦工藝最佳條件是酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、加酶量300 U/g、酶解時間3 h，可使苦味值降低為1.2。

一般來說內肽酶水解物易產生苦味，而外肽酶水解物基本上不產生苦味，故Alcalase堿性內切酶水解大豆分離蛋白后水解物往往產生一種令人難以接受的苦味，隨著大豆蛋白水解度的增大，原來包裹在分子內部呈苦味的疏水性基團暴露出來，含有的疏水性基團的多肽會使人的味蕾產生苦味。通過加入Flavourzyme風味蛋白酶可以進行脫苦處理，可以將疏水性氨基酸從蛋白質末端切掉，由于有利的疏水性氨基酸并不產生苦味，因此可以有效地減少水解液的苦味。在最佳酶解條件下，苦味分值達到最低，取得了較好的脫苦效果。

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