益生菌的功能活性及其分子機理探究的研究進展

劉 齊，孫美玲，王魯峰，潘思軼*

（1.湖北大學知行學院 生物工程系，湖北 武漢 430011；2.華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢 430070）

益生菌起源于共生的生態學語probiosis。其定義為通過改善腸道內菌群平衡，對宿主起到有益作用的活性微生物[1]。以益生菌為原料制成的產品也就是通常所說的微生態制劑，其作用是用來改善腸道菌群結構、抑制有害微生物生長，提高人體免疫力。

作為微生態制劑的益生菌必須符合以下幾個條件：耐酸耐膽汁，能夠以存活的狀態到達腸道內；能夠在腸道內定植并且能夠在腸道內增殖；已經被科學證實能夠改善腸道內菌群結構并且能夠起到有益作用；已經證實是安全可靠的或原本就是腸道菌群中的一種；存活在食品中能夠保持有效的數量。

益生菌最早由俄國微生物學家在20世紀初發現，發展至今已有一個多世紀。在這一個多世紀中，出現了大量益生菌相關的學術專著，同時益生菌的概念以及功效已經被科學家和消費者所認同。目前隨著現代科學技術的不斷發展以及學科交叉程度的加深，益生菌的相關研究也取得了非常多的重大突破。但是由于人或動物腸道中的微生態環境非常復雜，微生物與微生物之間存在有共生、競爭等多種相互關系，目前益生菌的生理功能及分子作用機理還知之甚少。歸納有以下幾個方面：

1 加強粘膜屏障

作為腸道中能夠正常定植的益生菌，不僅能夠在人體腸道中形成優勢菌群而且能夠緊密結合在腸粘膜上構成一道天然生物屏障，使得整個人體腸道處在“健康”狀態。目前大量體外和體內試驗表明，作為益生菌中一種的乳酸桿菌能通過分泌有機酸使得環境中pH值降低、產生次生代謝產物（抑菌毒素）、與腸道中有害細菌競爭性獲得營養物質以及形成膜菌群等方式來抑制致病菌或條件性致病菌的生長，從而保護腸道生物屏障[2]。REN Z G等[3]在研究肝臟移植手術后腸道障礙功能時發現相對于空白對照而言，喂食雙歧桿菌和乳桿菌對于術后腸道屏障功能的恢復與提高有顯著幫助，不僅如此，這些益生菌對于改善腸道微生物菌群結構也能夠起到非常積極、有效的作用。目前，關于益生菌對于腸道屏障功能提高的研究主要集中在嬰幼兒的研究上，尤其是早產嬰兒中居多。

研究發現，益生菌的適當補充能夠有效的降低早產嬰兒的壞死性結腸炎發病率以及死亡率，益生菌在治療成人與小孩的急性腹瀉感染的治療是非常有用的。BINNS C等[4]通過對于嬰幼兒抗生素引起的腹瀉案例數據分析比較之后發現益生菌能夠有效阻止該種腹瀉的發生。上述研究結果指出益生菌對于治療嬰幼兒腹瀉能夠起到顯著性效果，同時也指出雖然益生菌能夠有效治療嬰幼兒腹瀉癥狀但是不能夠有效預防嬰幼兒腹瀉癥狀的發生。HOYOS A B等[5]對于當地早產兒使用益生菌制劑，對比于歷史數據發現，益生菌能夠有效增加早產兒體質量，同時能夠使得壞死性小腸結腸炎的發病率降低75%，由壞死性小腸結腸炎引起的早產兒死亡率降低25%。LIN H C等[6]對臺灣地區早產兒的相似研究也表明益生菌輔助療法能夠有效的降低壞死性小腸結腸炎的發病率與致死率。BIN-NUN A等[7]對于以色列地區體質量低于1.5kg的早產兒采用雙盲實驗發現使用益生菌制劑的早產兒壞死性小腸結腸炎發病率從14%降為1%。隨著元分析方法的不斷發展，更是使得益生菌腸道保護的研究得到了進一步的發展。DESHPANDE G等[8]利用元分析方法確定了益生菌長期治療早產兒壞死性小腸結腸炎的菌種、菌株、用量、服用形式等因素。益生菌能夠治療早產兒壞死性小腸結腸炎的生理機制是由多方面所影響的。主要的機理是一方面益生菌在小腸末梢和結腸處益生菌能夠起到生物反應器功能，其能夠發酵代謝大量短鏈脂肪酸、乳酸、醋酸等物質合成早產兒需要的維生素、抗菌素和生長發育所必需的脂肪酸等物質；另一方面是由于處在小腸與回腸處的益生菌能夠提高宿主的抵抗力（如加強腸道黏附、增加黏液分泌、加強腸道運動型、分泌產生保護功能的營養物質）或者是通過增加有益微生物的數量來抑制有害微生物的生長[9]。而上述2種生理機制都是基于Toll樣受體（Toll-like receptors，T LR）分子調節機制所控制。從分子水平上來說，益生菌之所以能夠起到腸道保護和調節腸道內微生物群落結構的作用主要是基于益生菌表面的脂多糖、鞭毛以及脂磷壁酸等表面結果形成相應活性細胞因子，然后通過胞間信號通道刺激NFκ-B轉錄因子轉錄增加TLR受體分子的表達從而達到腸道菌群平衡和上皮細胞修復[10-12]。

2 抗菌效應

作為存在于人體或動物腸道中的非致病性細菌，益生菌對于腸道的健康和平衡起到非常重要的作用。益生菌主要是通過細菌拮抗、免疫調節或者是腸上皮細胞組織結構改變的方式來調節腸道健康與身體健康。目前公認的益生菌抗菌效應模式有以下幾種：（1）競爭性或拮抗作用；（2）增加消化酶活性；（3）降低有害細菌酶活與氨產物；（4）增加消化；（5）中和腸毒素或者刺激免疫系統[13]。

GIANNENAS I等[14]以300d大的肉雞為實驗材料，評價不同益生菌作為飼料補充劑對于艾美爾球蟲的抑制作用。6周的實驗結果顯示復合益生菌飼喂的肉雞體質量明顯高于受感染的對照；在回腸和小腸中，乳桿菌組肉雞的益生菌數量明顯高于其他組。說明益生菌通過競爭性抑制回腸和小腸中有害微生物的生長，從而增加肉雞體質量。CARLO C等在從大西洋鱈魚腸道中分離得到的2株益生菌（GP-12與GP-21）對于霍亂弧菌和沙門氏菌的抑制作用試驗中發現這2株益生菌對于腸道上皮細胞的黏附喜好是不同的。GP-12對于腸道前中段細胞的黏附性較強而GP-21對于腸道后端上皮細胞的黏附性較強；霍亂弧菌與腸道上皮細胞的黏附性明顯受到GP-12和GP-21的影響且符合競爭性抑制機制特點，而GP-21對于沙門氏菌的抑制符合競爭性特點而GP-12卻是另外特殊的機制；在鏡檢觀察中發現GP-21存在明顯自我聚集現象而GP-12存在和腸道菌共生的現象。CARLO C L等[15]的實驗說明益生菌抑制腸道有害菌的生長有賴于上皮細胞的種類和他們之間的作用關系。DELGADO S等[16-18]在體外試驗中也發現益生菌能夠通過與沙門氏菌、大腸桿菌等腸道有害細菌競爭性結合Caco-2細胞來抑制上述有害細菌的生長。

除了通過競爭性或拮抗維持正常的腸道微生物群落關系的機理之外，益生菌還可以通過產生次生代謝產物來增加消化酶活性或降低有害細菌酶活。SARIENA S T等[19]通過體外實驗評價了15種益生菌對于革蘭氏陽性和陰性有害微生物的抑制作用。在實驗中發現抑制微生物生長的其中主要的一個原因就是益生菌在糖發酵過程中產生的有機酸類物質抑制了微生物生長，降低了環境pH值。BANDA I G L等[20]在從塞內加爾鰻魚腸道中分離的益生菌對美人魚發光桿菌抑制作用的研究發現對照和Pdp11飼喂的鰻魚的腸道和肝臟細胞中出現大量脂肪球聚集。說明益生菌通過激發脂蛋白的合成來改變上皮細胞的功能，從而抑制有害微生物的生長。

3 影響免疫系統

益生菌對機體免疫的影響，主要通過調節參與吞噬功能的一系列細胞因子的分泌來實現。當腸道內存在有益生菌的時候，人體內的單核細胞和巨噬細胞（吞噬細胞）、嗜中性粒細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞（多形核白細胞）的活力會被激活。在上述細胞的活動下，大量的活性氧、溶酶體酶、白介素（interleutin，IL）和干擾素（interferon，IFN）等[21]免疫因子產生，從而增強人體免疫力。藍景剛等在關于雙歧桿菌增強機體免疫力的試驗中發現向小鼠腹腔中注射雙歧桿菌能夠有效增強小鼠NK細胞及激活的殺傷（lymphokine-activated killer，LAK）細胞活性，與此同時腹腔局部的細胞因子IL-1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-6活性增強，而這些細胞因子都是由巨噬細胞分泌而來。葛鳳霞等[22]報道，向小鼠腹腔中注入乳酸桿菌后，巨噬細胞活性指示酶——酸性磷酸酶、非特異性酯酶的數量明顯增加。柳洪潔等[23]報道干酷乳桿菌（Lactobacillus casei）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）可以通過刺激機體內免疫細胞（巨噬細胞、淋巴細胞）活性來提高機體的免疫力。

有些益生菌在進入到機體腸道中后，能夠迅速形成優勢菌群、調整腸道菌群結構，活化腸粘膜相關淋巴組織、促使其分泌大量分泌型免疫球蛋白A（secretory lgA，SIgA），從而提高機體免疫力。PERDIGON G等[24]研究發現嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌能顯著增加動物腸黏膜的免疫反應，促進腸道分泌型免疫球蛋白（SIgA）的分泌。分泌型免疫球蛋白（SIgA）在粘膜免疫的過程中能夠中和腸道中有害細菌產生的毒素、限制腸道粘膜上皮的有害細菌以及病原體生長、甚至在腸道粘膜局部抗感染過程中也起到非常重要的作用。益生菌不光能夠刺激分泌型球蛋白的分泌，其同樣能夠刺激其他分泌型抗體的產生。柴家前等[25]在對飼喂了乳桿菌的雛雞進行消化道中抗體濃度連續性觀測的試驗中發現益生菌能夠在早期顯著提高雞消化道分泌型IgA抗體的濃度。

4 抑制腸道疾病

益生菌抑制腸道疾病主要是通過拮抗功能抑制有害微生物的成長，從而改變腸道微生物菌群結構起到抑制腸道疾病的作用。益生菌在現代疾病治療中起到重要作用。大多數可行的臨床研究顯示作為安慰劑的益生菌對于特殊的病癥有明顯作用，如阻止抗生素介導的腹瀉、急性胃炎的治療、過敏性腸炎以及幽門螺桿菌感染等。

目前公認的口服益生菌主要通過以下3種方式來抑制疾病的發生：1）改變腸道的微生態狀態；2）作用于腸黏膜障礙；3）通過與腸道相關免疫系統的作用調節免疫反應[26-27]。目前的證據顯示益生菌的抗病作用機制非常獨特，每個益生菌種都能產生自己的一套抗病機制。然而其效果均依賴于使用的劑量以及服用的頻率。益生菌抗病機制總結如圖1所示。

圖1 益生菌抗病作用機理[28]Fig.1 Mechanisms of probiotics resistance effect

5 抑制抗生素介導的腹瀉

抗生素介導的腹瀉是抗菌治療的普遍存在的副作用。許多研究者相信抗生素介導的腹瀉是由于腸道微生物菌群改變所致，然而也有學者認為引起此種腹瀉的主要是梭狀芽孢桿菌。目前研究顯示梭狀芽孢桿菌風險部分依賴于抗生素服用的時間和抗生素的劑量（服用抗生素18d后，其相關風險系數為7.8）。與之相關性最強的抗生素有喹諾酮類、阿莫西林、頭孢以及克林霉素等抗生素[29]。JOHNSONS等[30]在益生菌對梭狀芽孢桿菌感染的人群影響實驗中發現，在接受抗生素治療的人群中，服用益生菌作為梭狀芽孢桿菌感染前期預防的效果要比不服用要好的多。推測其原因可能是因為宿主腸道微生物菌群已經被改變。該研究從11個樣本試驗中發現，嗜酸乳桿菌CL1285以及干酪乳桿菌LBC80R能夠有效地預防梭狀芽孢桿菌的感染。KONING C J等[31]通過38名健康人群研究發現，服用了不同益生菌的人群每天排便次數顯著高于服用安慰劑（不含有益生菌）的人群，雖然在所有受試人群糞便中都檢測到梭狀芽孢桿菌及其毒素。

6 抑制術后并發癥

RAYES N等[32-33]在肝臟移植手術過后采用益生菌作為治療藥物分別對95名以及66名病人進行雙盲實驗后發現，在術后第1天連續服用益生菌的病人中術后感染并發癥的發病率從48%分別減少到13%和3%（P=0.017）。LIU Z等[34]在結腸手術過后采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及雙歧桿菌作為治療藥物對100名病人進行試驗后發現，在術前6d到術后10d時間內服用上述益生菌能夠將術后并發癥發病率從46%降低至14%。同時LIU Z等[34]還發現服用益生菌的受試人群體內乳糖/甘露糖比例下降以及封閉蛋白以及閉合蛋白早在腸道上皮細胞附近緊密結合。

7 抑制感染并發癥

近10年有8篇關于益生菌抑制急性重癥患者敗血癥并發癥相關的研究，其結果見表1。其中5篇研究發現益生菌能夠顯著降低重癥患者并發癥的發病率。其中有2篇是研究益生菌對于多創傷重癥病人的并發癥抑制作用，結果顯示益生菌能夠通過調節腸道屏障功能以及改變免疫調節功能抑制并發癥的發生。在這些研究中發現受試病人體內循環脂多糖數量降低，同時腸道中微生物生長滯后，說明益生菌在調節腸道屏障作用、阻止脂多糖介導的微生物生長與轉移、修復Th1/Th2細胞因子應激反應平衡等方面都起到巨大的作用。

8 抑制腫瘤生長

人類腸道中存在有一個復雜豐富的微生物群體（1013～1014CFU）。這些內生微生物與其的真核宿主形成了共生關系而起這種緊密的共生關系幫助其與宿主形成了體內平衡。然而這種共生關系會受到許多因素（感染、飲食、壓力、炎癥）的左右從而影響健康甚至導致腫瘤的產生尤其是結腸癌。研究顯示結腸癌產生的刺激因素主要是炎癥環境以及腸道內的微生物組成。這主要是因為腸道中的微生物能夠引起大量提高癌癥風險的生理生化反應。這其中包括上皮細胞增殖控制、必需營養物質和生物活性物質的產生以及致病菌生長繁殖等[43]。SOBHANI I等[44]通過對比結腸癌病人和正常人群糞便中微生物組成發現結腸癌病人糞便中擬桿菌以及普氏菌數量明顯多于正常人群。說明結腸癌的發生和宿主腸道內微生物組成有著一定的關聯。而許多研究證明益生菌對于抑制結腸癌的發病及其前導損傷方面能夠起到積極的效果。

表1 近十年進入加護病房重癥病人利用益生菌治療研究（雙盲實驗）匯總[35-42]Table1 Summary of results of probiotic preparations administered in icu critically ill patients in a decade (double blind experiment)

益生菌抑制癌癥的精確機制可能是一個多渠道調節，這其中包括細胞增殖、活性氧、細胞凋亡、特殊酶產物以及影響宿主代謝組等方面。CAPURSO G等[45]通過體外實驗發現嗜酸乳桿菌GG能夠使得HGC-27以及DLD-1癌癥細胞中的多元胺減少，從而抑制癌癥細胞分裂增殖。KIM Y等[46]在雙歧桿菌SPM0212抗癌活性以及細菌酶活抑制試驗中發現，該菌株能夠通過抑制β葡萄糖醛酸酶、β葡糖苷酶以及脲酶來有效抑制HT-29、SW480以及CACO-2癌癥細胞的增殖。PARK E等[47]在評估多發酵芽胞桿菌（Bacillus polyfermenticus）對于雄性F334小鼠致癌作用及抗氧化效果的研究中發現，飼喂益生菌的小鼠其變性隱性病灶數量明顯低于空白組，同時血液中白細胞DNA損傷以及脂質過氧化水平均得到恢復。該研究說明B.polyfermenticus能夠通過降低體內活性氧作用抑制結腸癌的發生。PAGNINI C等[48]研究發現益生菌能夠通過一種“腫瘤監督”的生理學機制來抑制結腸癌的發生。

9 降低人體膽固醇含量

血清膽固醇水平直接關系到人們的健康。血清中膽固醇含量過高容易引發高血壓、冠心病等心血管疾病。以正常膽固醇水平為基礎，血清膽固醇每升高1mmol，機體患冠心病的危險大約增加35%，冠心病死亡的危險增加45%，相反血清膽固醇每減少1%，患冠心病的危險性就降低2%～3%[49]。目前許多體內以及體外研究已經證實益生菌能夠起到降低血清膽固醇含量的作用，而這些益生菌主要集中在乳桿菌中。NGUYEN T D T等[50]以小鼠為模型，將胚芽乳桿菌PH04喂食小鼠。結果發現與對照組相比，喂食胚芽乳桿菌PH04菌株14d后的小鼠中血清膽固醇（serum cholesterol，SC）和甘油三酸酯（triglyceride fatty acid，TG）分別下降了7%和10%，因此認為胚芽乳桿菌可以作為降膽固醇的益生菌。LIONG M T 等[51]在對嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）體外降低膽固醇的研究中也發現，2種微生物培養基中膽固醇的減少量與這2種菌體的生長情況密切相關。PEREIRA D I A等[52]在發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）體外降膽固醇實驗中發現其和嗜酸乳桿菌以及干酪乳桿菌一樣都具有降低血清膽固醇潛在能力。

目前關于益生菌降低血清膽固醇含量的機理主要存在吸收同化理論和共沉淀兩種認識。前者主要是GILLILAND提出，其通過向培養基中加入膽固醇物質觀察乳酸菌生長情況后發現培養基中的膽固醇含量明顯降低而乳酸菌胞內膽固醇含量明顯增加從而認為乳酸菌能夠通過同化吸收胞外膽固醇來降低環境中的膽固醇含量。LIONG M T等[51]在對11株乳酸菌體外膽固醇去除試驗中發現，生長于含有膽固醇培養基的菌體脂肪酸組成和不含有膽固醇培養基中菌體的脂肪酸組成存在有明顯差異。因此，其認為菌體吸收同化了培養基中的膽固醇形成自身物質。共沉淀理論則認為膽固醇水平的降低并不是由于乳酸菌的同化吸收而是由于膽酸鹽與膽固醇的共沉淀所導致的。TARANTO M P等[53]在研究羅氏乳桿菌（Lactobacillus renteril）降低膽固醇的試驗中發現，在加入膽固醇和未加入膽固醇的培養基中，L.renteril自身脂肪酸組成并沒有發生顯著性變化，而其膽鹽水解酶活性卻存在顯著性差異。其加入膽固醇的培養基中生長的L.renteril 中膽鹽水解酶活性明顯高于未加入膽固醇的培養基中生長的L.renteril。由此其認為L.renteril并沒有通過同化吸收作用去除掉環境中的膽固醇而是通過形成大量膽酸鹽與膽固醇形成沉淀來降低環境中膽固醇。

10 展望

盡管益生菌的概念在現在已經被大家越來越熟知，但是國內外關于益生菌的科學研究仍然需要不斷發展，尤其是對于益生菌的益生機理研究更是少之又少。雖然目前對于益生菌的功能活性與機理研究取得了一定的成績，但是許多機理都只是處在推測和假定階段，并沒有完全實質的證據證明這些機理的真實性和合理性。隨著基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組技術的不斷完善和發展，為益生菌的系統研究提供了很好的思路，可以更加準確地評價和篩選特定功能益生菌，為探究其益生機理提供了可靠的技術和工具。

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