山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的高效液相色譜法測定

楊宇霞，楊林娥，張 磊，韓建欣，彭曉光*

（山西省生物研究所，山西 太原 030006）

山西老陳醋是中國的四大名醋之一[1]，其不僅是人們生活必需的調味品，而且是一種保健養生食品，具有調節血糖血脂、降低血壓、抗癌等功效[2]。近年來，老陳醋的藥用保健作用越來越受到重視，其功能性成分也成為現代研究的熱點。川芎嗪學名四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP），是山西老陳醋的重要風味物質，也是山西老陳醋重要的功能成分之一，具有擴張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用[3]。乙偶姻（acetoin，ACT）學名3-羥基丁酮，是一種令人愉快的香味物質，為食品行業常用的香料品種，也是食醋中重要的風味物質。文獻報道，川芎嗪形成機制的一種假設是乙偶姻和氨氣反應形成的產物[4]。因此，準確測定山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的含量對山西老陳醋保健功能的開發及川芎嗪生成機理的探索具有重要意義。

乙偶姻的檢測方法多用氣相色譜法或者氣相色譜質譜聯用法[5-13]，其準確性較差、相對標準偏差較大，而液相色譜法報道較少[14]。余書奇等[15]建立了一種2，4-二硝基苯肼衍生-高效液相色譜測定葡萄酒中總乙偶姻的方法，但需要進行衍生化實驗，步驟繁瑣。張少飛等[16]建立了高效液相色譜法單獨測定山西老陳醋中的川芎嗪的方法。而乙偶姻和川芎嗪同時檢測的方法鮮有報道，只有陳繼承等[3]進行了一些研究。本實驗建立了山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的液相色譜測定方法，并針對實驗條件進行了優化，期望對山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：東湖、水塔、紫林、寧化府4個品牌的市售產品和相關企業提供的山西老陳醋；乙偶姻、川芎嗪標準品：上海阿拉丁試劑有限公司；甲醇（色譜純）：安徽時聯特種溶劑股份有限公司；乙酸（分析純）：天津市光復科技發展有限公司。

標準溶液的配制：準確稱取乙偶姻2.5g、川芎嗪25mg，用流動相分別定容至50mL容量瓶中，配制成乙偶姻50mg/mL，川芎嗪500μg/mL的標準儲備液。把乙偶姻、川芎嗪標準儲備液分別稀釋不同倍數，配制成混合標準使用液。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜儀：美國Agilent公司，配有四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、紫外檢測器和化學工作站；KQ-500D超聲波清洗儀：東莞市科橋超聲波儀器有限公司；TG16-WS高速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；NW150V超純水系統：上海康雷分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

取4mL樣品，調pH值為7.2，用提取劑定容至25mL。超聲提取45min，10 000r/min離心5min，去除沉淀，取上清液用0.22μm微孔濾膜過濾，上機測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（2）（4.6mm×250mm，5μm）；檢測器：紫外檢測器；檢測波長279nm；流動相：1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=70∶30；流速0.8mL/min。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的確定

分別選擇Agilent TC-C18（2）、Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Zorbax SB-Aq色譜柱進行篩選試驗，結果表明，Agilent TC-C18（2）色譜柱對乙偶姻和川芎嗪的保留時間和分離效果都較好，故最終選擇Agilent TC-C18（2）作為分析用色譜柱。

2.2 檢測波長的確定

用190～400nm紫外光對乙偶姻、川芎嗪標準溶液進行掃描，綜合考慮乙偶姻和川芎嗪的吸收強度，最終選擇二者都有較強吸收的279nm作為檢測波長。

2.3 提取劑的確定

分別用1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）和5%醋酸水溶液與甲醇以20∶80的比例混合，配制成提取劑1和2進行實驗，不同提取劑對乙偶姻、川芎嗪的提取峰面積結果見表1。由表1可知，提取劑1的提取效果明顯優于提取劑2，故確定1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=20∶80為實驗用提取劑。

表1 不同提取劑對乙偶姻和川芎嗪的提取效果Table 1 Extraction effect of ACT and TMP with different extraction solvents

2.4 提取劑比例的確定

分別配制甲醇體積分數為0、30%、50%、80%、90%、100%的提取劑進行實驗，結果見表2。由表2可知，隨著甲醇體積分數的增加，乙偶姻、川芎嗪的峰面積增大。當甲醇體積分數達到目的80%時，二者的提取效果最佳。甲醇體積分數繼續增加，二者的峰面積開始減小，故最終確定1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=20∶80為實驗條件。

表2 不同甲醇比例對乙偶姻和川芎嗪的提取效果的影響Table 2 Effects of methanol proportion on extraction effect of ACT and TMP

2.5 pH值的確定

取同一樣品，調節不同的pH值進行實驗。不同pH值下，乙偶姻、川芎嗪的提取峰面積結果如表3所示。從表3可以看出，隨著pH值的升高，二者的提取峰面積增大。當pH值達到7.2時，提取效果最好。隨著pH值的繼續增加，乙偶姻和川芎嗪的提取峰面積開始減小，故最終選擇pH值7.2為實驗條件。

表3 不同pH值對乙偶姻和川芎嗪提取效果的影響Table 3 Effects of pH on extraction effect of ACT and TMP

2.6 線性范圍、相關系數及檢出限

將乙偶姻和川芎嗪標準儲備液分別稀釋不同的倍數，配制成混合標準使用液系列，進樣分析。以乙偶姻和川芎嗪的峰面積（Y）對相應的質量濃度（X）進行線性回歸，以3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限，結果見表4。乙偶姻、川芎嗪混合標準溶液色譜圖見圖1。

表4 線性方程、相關系數及檢出限Table 4 Linear equation,correlation coefficient and detection limit

由表4可知，乙偶姻和川芎嗪在所測試質量濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數均達到0.999 99，檢出限分別為7.335μg/mL、0.068μg/mL，高效液相色譜法同時測定乙偶姻和川芎嗪線性范圍寬，檢測限低，具有較高的靈敏度。

圖1 乙偶姻、川芎嗪混合標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution of ACT and TMP

2.7 精密度

將同一老陳醋樣品，按1.3節色譜條件連續進樣6次，對乙偶姻和川芎嗪的峰面積進行測定，結果見表5。

表5 方法精密度實驗結果Table 5 Results of precision experiments

由表5可知，乙偶姻和川芎嗪峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.67%和0.20%，表明方法精密度較好。

2.8 回收率

取同一老陳醋樣品，采用樣品加標的方法計算回收率，結果見表5，老陳醋加標色譜圖見圖2。從表6可以看出，乙偶姻、川芎嗪的加標回收率在96.5%～104.1%之間，方法準確性較高，適合于山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的檢測分析。

表6 方法回收率實驗結果Table 6 Results of recovery rate experiments

2.9 樣品的測定

按照上述方法，對幾種品牌山西老陳醋樣品進行測定，結果見表7。

圖2 山西老陳醋加標色譜圖Fig.2 Chromatogram of Shanxi aged vinegar spiked with ACT and TMP

表7 山西老陳醋樣品中乙偶姻和川芎嗪的含量Table 7 Content of ACT and TMP in Shanxi aged vinegar samples

由表7可知，山西老陳醋樣品中均含有不同質量濃度的乙偶姻和川芎嗪，但不同品牌山西老陳醋樣品乙偶姻和川芎嗪的含量存在一定的差異，乙偶姻的質量濃度分布范圍0.95～3.00mg/mL，川芎嗪的質量濃度范圍在44.74～285.68μg/mL之間。可見，乙偶姻和川芎嗪是山西老陳醋中重要的風味物質，一定程度上可以反映山西老陳醋的保健功效。

3 結論

川芎嗪和乙偶姻都是山西老陳醋中重要的風味物質，采用酸性甲醇溶液提取，高效液相色譜法測定，乙偶姻、川芎嗪的回收率在96.5%～104.1%之間，相對標準偏差（RSD）≤1.67%，方法前處理簡單，精密度高、準確性好，該方法可作為山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪含量測定的參考方法，為山西老陳醋的品質控制和保健功能的開發提供依據。

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