酵母抽提物鮮味（umami）及濃厚味（kokumi）滋味活性的評價與研究

劉建彬，宋煥祿

（北京工商大學 分子感官科學實驗室，北京 100048）

作為天然食品，酵母抽提物（yeast extract，YE）廣泛應用于食品的調香及調味[1]。YE是采用面包酵母、啤酒酵母等原料經發酵、自溶、水解、濃縮等工藝制成的膏狀或粉狀產品[2]。YE富含氨基酸、核苷酸、多肽及B族維生素，這些化合物同時也是其典型風味的物質基礎[3]。在現代食品工業中，YE具有兩大作用：一方面，作為風味原料或氣味前驅物，應用于食品氣味的增強尤其是肉味的增強中[4]；另一方面，其還常作為滋味促進劑而被應用于食品的提鮮中[5]。YE是一種極佳的風味增強食品，具有很好的應用前景。

鮮味（umami）是最近被人們認可的一種基本味，其經常被形容為谷氨酸及其鹽類的味道。自從1908年被發現以來，多種化合物如谷氨酸及其鈉鹽、天門冬氨酸及其鈉鹽、5’-核苷酸及其鈉鹽、琥珀酸及其鈉鹽等被鑒定出具有鮮味[6]。濃厚味（kokumi）這一概念是由日本科學家提出來的，被形容為滿口感和味覺復雜感[7]。作為一種滋味增強劑，有濃厚味效果的物質本身通常沒有味道或者沒有其所表現的味道。近些年的研究發現，多種小肽具有重要的濃厚味效果[8-10]。谷胱甘肽是第一種被明確鑒定出具有濃厚滋味效果的物質[11]。在鮮味呈現機制的研究中，L-谷氨酸選擇G蛋白，代謝型谷氨酸受體4亞型（metabotropic glutamate receptor 4，mGluR4）和代謝型谷氨酸受體1亞型（metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1），味蕾表達異質二聚體T1R1+T1R3等受體對鮮味具有關鍵作用，進一步的研究發現，在有核苷酸、多肽等多種物質存在時，多個味覺受體表現出復雜的協同關系[12]。而味蕾上的鈣離子受體（calcium-sensing receptor，CaSR）被明確報道為kokumi物質的味覺受體，可以起到對咸味、甜味、鮮味多個滋味的提升作用[13]。

目前關于YE風味的研究中，多集中在對其氣味活性化合物的探索[4，14-16]。滋味方面，FESTRING D等[5]從酵母抽提物模型美拉德反應體系中鑒定出鮮味提升N2-（1-羧乙基）-鳥苷-5’-單磷酸鹽。而其他尚無關于YE滋味活性的尤其是umami及kokumi的報道。

本研究采用切向流超濾（ultra-filtration，UF）、凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC），高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等分離技術，對YE中的umami及kokumi活性組分如肽段、5’-核苷酸及谷胱甘肽進行分離、定性及定量。應用模型溶液構建、描述性感官鑒評、時間-反饋鑒評、劑量-反饋鑒評技術對YE的umami和kokumi活性進行描述和評價。為YE在滋味促進方面的應用提供支持和指導。

1 材料與方法

1.1 材料

普通酵母抽提物（normal yeast extract，NYE）、高純酵母抽提物（high pure yeast extract，HPYE）、高肌苷酸（Inosine monophosphate，IMP）+鳥苷酸（guanosine monophosphate，GMP）酵母抽提物（HIGYE）：湖北安琪酵母有限公司；實驗室用高純水：Millipore Simplicity 系統自制；KH2PO4、Tris-HCl緩沖液、磷酸緩沖液、甲醛、5，5’-二硫代二硝基苯甲酸（5，5’-dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB）染液、蔗糖、乳酸、咖啡因、NaCl、谷氨酸鈉、肌苷酸、鳥苷酸：國藥集團試劑公司；雞肉粉：春發生物科技公司；5’-腺苷酸（5’-adenosine monophosphate，5’-AMP）、5’-肌酸酸鈉（5’-inosine monophosphate，5’-IMP）、5’-胞苷酸（5’-cytidine monophosphate，5’-CMP）、5’-GMP、VB12、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、甘氨酸（glycine，Gly）、抑肽酶標準品：美國Sigma公司；其他色譜純試劑均購自美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

1200 Series高效液相色譜系統：美國安捷倫公司；Mini Pellicon切向流超濾系統：德國默克密理博公司；?KTA蛋白純化儀：美國GE公司；ALPHA1-4 LSC冷凍干燥機：德國Christ公司；UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 滋味水溶提取物的制備

取20g酵母粉狀酵母抽提物溶于200mL高純水中，室溫充分攪拌溶解，超聲均質10min，抽濾后進行下步分離。

1.3.2 不同分子量滋味餾分的超濾分離

滋味水溶性提取物采用切向流超濾系統進行分離。溶液依次通過5 000u、1 000u分子截留量超濾膜包多次分級分離。分別合并多級截留液和透出液，冷凍干燥。制得酵母抽提物＞5 000u、＜5 000u、1 000u～5 000u和＜1 000u粗分子質量組分。稱質量，置于-20℃備用。

1.3.3 滋味活性肽的凝膠色譜層析分離

YE原始樣品、＜5 000u組分在?KTA蛋白純化系統中進一步進行凝膠色譜層析分離。系統配有P-900泵，UV-900三波長檢測器，pH/900 pH檢測器及Frac-920自動收集器。1g樣品溶于1mL高純水中，各組分經一根GE Superdex peptide 10/300 GL色譜柱進行分離，上樣量100μL，流動相為純水，用1%甲酸調整pH值為0，流速0.5mL/min。測定波長220nm及280nm條件下的吸光度值，樣品被分為7個餾分（I-VII），分別收集合并，經冷凍干燥置于-20℃備用。

為了確定酵母抽提物中的多肽分布，同樣條件下用抑肽酶（6512u）、VB12（1343.3u）、還原型GSH（307.3u）、Gly（75u）制作分子質量標準曲線。

1.3.4 谷胱甘肽含量的測定

谷胱甘肽是酵母抽提物中明確含有的kokumi物質。谷胱甘肽的含量采用5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）法按照趙旭東等[17]的測定方法進行測定，母液濃度為0.01g/mL。

1.3.5 5’-核苷酸含量的測定

5’-核苷酸鈉鹽是重要的umami物質，酵母抽提物中5’-核苷酸鈉鹽含量的測定采用CHO I等[18]的方法經一些改進進行。0.5g樣品溶于25mL水中，煮沸1min，冷卻，過0.45μm濾膜備用。樣品進HPLC系統進行分析。系統配備G1322A真空在線脫氣系統，G1311A四級泵，G1329A自動進樣器及G1316A柱溫箱。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，柱溫控制為20℃，流動相為50mmol KH2PO4，用磷酸調整pH值為4.3，流速為1mL/min。采用各5’-核苷酸標準品做標準曲線進行定量。

1.3.6 感官鑒評

（1）感官訓練

感官鑒評小組包含有7名成員（3男4女）。為了使成員熟悉感官鑒評指標，進行了為期兩個月的感官鑒評訓練，每天訓練的時間大于1h。用50mmol/L的蔗糖來訓練甜味；用20mmol/L的乳酸來訓練酸味；用20mmol/L的NaCl來訓練咸味；用1mmol/L的咖啡因來訓練苦味；3mmol/L的谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）來訓練鮮味；配制含有10mmol/L谷氨酸鈉和20mmol/L NaCl的鮮味模型溶液，添加5mmol/L的谷胱甘肽來訓練kokumi滋味的鮮味提升作用；配制含有10mmol/L NaCl和雞肉粉的空白雞湯溶液，添加5mmol/L的谷胱甘肽來訓練kokumi滋味的復雜口感作用。小組商定采用采用含10mmol/L的谷氨酸鈉溶液的滋味作為基本鮮味標度。小組成員之間互相交流商議確定描述性語言。所有的訓練分3個部分進行，每個部分間隔5min用清水漱口，整個訓練和評價在25～30℃進行。

（2）描述性鑒評實驗

進行描述性鑒評式樣對酵母抽提物及其個分離餾分的umami及kokumi滋味活性進行定性描述。相同質量濃度的各酵母抽提物原液、酵母抽提物超濾分離餾分、凝膠層析分離餾分均送感官鑒評小組進行描述性鑒評。對于鮮度和鮮味提升的鑒評，采用評分法，從0～10表示鮮味從沒有檢出到非常強烈。原液描述鑒評實驗采用3種模型溶液：MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液、（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液、空白雞湯-NaCl（10mmol/L）模型溶液。各餾分鑒評只采用標準MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液。

（3）感官反饋實驗

為了確定酵母抽提物對鮮味劑的作用，對不同質量濃度高純酵母抽提物進行了感官反饋實驗（sensory-response experiment，SRP）[19]。對于劑量-反饋實驗（dose-responseexperiment，DRE），一系列質量濃度0、0.05g/L、0.25g/L、0.50g/L、2.50g/L、5.00g/L、25.00g/L的酵母抽提物樣品分別添加至MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液和（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液中。感官鑒評小組對各溶液的鮮味強度進行評分。對于時間-反饋實驗（Time-response experiment），取0.5g/L高純酵母抽提物于（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液，0.3g/L高純酵母抽提物于MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液中進行鑒評。從入口（sip）開始計算，要求鑒評人不斷咂口，每1s對鮮度進行評分，5s時吐出（spit），并持續咂口對余味進行評分，持續至10s結束。所有鑒評分3組取平均值，同組同人評分差異不得超過2個標度。作折線圖來表示滋味反饋輪廓。

為了保證鑒評人員安全且高效率鑒評，所有鑒評采用啜食技術[8]。溶液在口中旋轉鑒評而不咽下每個樣品和樣品鑒評之間都使用清水進行漱口。

1.3.7 數據統計和分析

凝膠色譜數據采用UNICORN manager分析軟件進行分析；HPLC定量數據采用Agilent化學工作站B.02.01進行分析；其他差異性分析均采用SPSS 19.0進行分析。

2 結果與討論

2.1 酵母抽提物umami及kokumi滋味活性的評價

2.1.1 描述性鑒評

3種樣品描述鑒評結果見表1，高純酵母抽提物樣品HPYE具有刺舌的苦味和輕微的鮮味，并沒有體現濃厚和復雜的鮮味；高I+G樣品HIGYE具有典型的濃厚、持續的鮮感；普通樣品具有中等苦味和中等的鮮感，有一定的濃厚感。這個結果說明了酵母抽提物中的kokumi活性物質與I+G具有増鮮、提升濃厚感、持續口感的作用。

對比酵母抽提物添加前后模型溶液的滋味特性（表1）。添加前模型溶液的鮮味具有寡淡感，單調且消失迅速，MSG-NaCl模型溶液還具有不愉快的金屬后味。而添加后的溶液的鮮味被感官鑒評小組描述為具有一種飽滿、持久的感覺。這種差異將其與典型鮮味模型區分開來。對空白雞湯的實驗表明，酵母抽提物對湯汁具有增加滋味復雜度，濃厚度的作用，同時，還有一定掩腥的效果。另外，酵母抽提物對I+G較MSG有更強的kokumi作用。

表1 酵母抽提物(YE)及鮮味模型溶液的描述性感官評價Table 1 Descriptive sensory evaluation of YE and umami-model solution

2.1.2 感官反饋實驗

圖1 添加酵母抽提物的鮮味模型溶液的劑量-反饋輪廓圖Fig1 Dose-response diagram of umami-model solution with YE

劑量-感官反饋實驗形象地反映了酵母抽提物對鮮味模型的釋放、消失的作用。由圖1可知，隨著YE用量的增加，兩種模型溶液的鮮味強度逐步增強。對于MSG-NaCl模型溶液，YE質量濃度達到0.25g/L時才體現出快速的増鮮效果，到2.5g/L時達到最大増鮮效果，感官鑒評也發現，在這一YE用量時，溶液開始呈現一定的苦味。對于I+G+NaCl模型溶液，YE對其鮮味提升更為明顯，增鮮閾值較低（約0.05g/L），而到5g/L用量時達到最大鮮度，也開始呈現出一定的苦味。

時間-反饋實驗揭示了不同樣品鮮味在口中變化，即一種樣品的味覺時間輪廓圖。由圖2可知，隨著樣品的啜食，未添加YE的樣品的鮮度迅速達到最高值，繼而迅速消失；而添加有YE的樣品鮮味釋放時間長且消失時間也較長，具有持久的鮮感。整體來看，YE對I+G及MSG都有明顯的増鮮作用。由圖2可知，在溶液剛吐出時，4種溶液的鮮度都有一個回升的過程，這對鮮味的后味呈現有很大影響。

圖2 添加酵母抽提物的鮮味模型溶液的時間-反饋輪廓圖Fig.2 Time-response diagram of umami-model solution with YE

表2 酵母抽提物鮮味和濃厚味相關化合物定量數據Table 2 Quantitative data for compounds related to the umami and kokumi of YE

2.2 超濾滋味餾分的篩選與鑒定

應用切向流超濾系統，將YE中的水溶性滋味化合物分為＜1 000u，1 000～5 000u，＞5 000u三個部分，各部分的含量見表2。由表2可知，高純YE和高I+G YE的＜1 000u組分較普通YE高，且后者更高。這可能是由于較高含量的I+G導致的結果。普通YE有較高的＞5 000u的組分。這組結果說明在YE中大部分為＜1 000u的組分（純YE含量達90.2%）。

對等量3組餾分單獨及加入模型溶液進行感官鑒評，結果見表3。由表3可知，在YE中呈現kokumi效果的組分集中在＜1 000u分子質量，而1 000～5 000u組分也有輕微的kokumi效果，而＞5 000u組分完全沒有效果。單獨品嘗發現，這些呈強烈kokumi效果的物質本身呈苦味，且具有強烈、爽快的刺舌滋味。確定以＜1 000u組分目標物，進行下一步凝膠色譜層析分離。

表3 酵母抽提物超濾組分的滋味及濃厚味效果評價Table 3 Sensory evaluation of kokumi taste of ultrafiltration components of YE

2.3 凝膠色譜分離滋味餾分的篩選與鑒定

經凝膠色譜層析分離，共分離出7個餾分（圖3）。收集并冷凍干燥后，對各個組分原樣和添加至模型溶液滋味進行鑒評，結果見表4。由表4可知，其中GPC-II和GPC-III，本身具有苦味，微鮮和強烈尖刺滋味，添加至模型溶液中具有強烈kokumi 和増鮮效果。經分子質量標準曲線計算，2種餾分分子質量處于200～1 000u之間。初步判斷為含有2～8個氨基酸的小肽。

圖3 高純酵母抽提物中＜5 000u組分的凝膠過濾層析色譜圖Fig.3 GPC chromatogram of the ＜5 000 u fraction of high pure yeast extract

2.4 酵母抽提物肽的分子量分布

對3種YE的全組分進行凝膠色譜層析分離測定其肽段分布，結果見表2。從表2結果可以看出，＜1 000u肽段仍是YE中的主要組成成分（約70%）。對比3種YE發現，高I+G YE及普通YE的＜1 000u組分含量偏高，這是由于其中高含量I+G干擾作用所致，同時對高I+G YE餾分II和III收集鑒評發現，其本身就呈現強烈的酸鮮和kokumi滋味。

表4 酵母抽提物中凝膠過濾層析餾分單獨及在模型溶液中的感官評價Table 4 Sensory evaluation of single GPC fractions in water and in a model solution

2.5 谷胱甘肽含量

對3種YE的谷胱甘肽含量進行測定，標定參數見表5，測定結果見表2。表2結果顯示，高純YE中谷胱甘肽含量最高（6.828mg/g），普通YE次之，高I+G YE最低。這說明純品YE是谷胱甘肽的主要來源。谷胱甘肽也是比較明確的具有典型kokumi效果的肽類化合物。

表5 酵母抽提物中相關滋味化合物定量標定參數Table 5 Calibration data used for quantification of taste-active compounds of YE

2.6 5’-核苷酸含量

5’-核苷酸是YE中賦予鮮味的主要物質基礎。對4種核苷酸5’-AMP、5’-IMP、5’-CMP、5’-GMP的含量進行了測定，標定參數見表5，測定結果見表2。高I+G樣品具有高含量的5’-IMP和5’-GMP，同時其5’-CMP含量也很高，但是并未在此樣品中發現5’-AMP，可能是生產過程中定向發酵轉化的結果。剩余的2個樣品中，4種核苷酸均有發現。且普通YE較高純YE各含量都高。可以得出結論，純品YE中的核苷酸含量尤其是呈味核苷酸的含量極低（約3.530mg/g），以至于并未與其中所含的kokumi成分協同發揮效果，僅有輕微鮮味。可以通過定向發酵及人工復配的方式提高I+G含量，生產出高協同、高鮮的YE產品。

3 結論

對3種YE（高純YE、高I+G YE、普通YE）的umami及kokumi滋味進行了評價和描述。通過超濾、凝膠層析對YE滋味組分進行了分離，初步得出分子質量處于200u～1000u的肽類，本身具有苦味及強烈刺舌滋味，對MSG-NaCl、I+G+NaCl、雞湯-NaCl模型溶液具有増鮮，增加復雜口感及持續的滿口感的kokumi效果。對3種YE的粗分子質量分布、肽分布、核苷酸含量、GSH含量進行了測定。結果得出，YE中＜1000u分子質量肽含量很高（約70%），為其主要滋味基礎。通過對MSG-NaCl、I+G+NaCl模型溶液做反饋感官鑒評，得出YE濃度分別達到0.25g/L、0.05g/L時開始體現出増鮮效果，而在2種模型溶液中分別達到到2.5g/L，5g/L濃度時達到最大増鮮效果，超過這一濃度時，溶液開始呈現一定的苦味。此外，對于I+G+NaCl模型溶液，YE對其鮮味提升更為明顯，增鮮閾值較低。

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