濃香型大曲中酶系與白酒品質的關系研究

王曉丹，班世棟，胥思霞，王榮村，沈錫翠，邱樹毅*

（1.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州青酒集團有限責任公司，貴州 鎮遠 557702；3.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

大曲是釀酒中的糖化劑、發酵劑和生香劑，是發酵過程中一些酶產生的必需物，所以有“曲為酒之母”的說法。不同香型的白酒的用曲量是不同的[1]，濃香型大曲用量為20%左右，而醬香型白酒的用曲量可以達到85%～95%[2]，不同品質的大曲形成白酒香味成分也不同[3-6]，優質曲所釀造的酒中總酸、總酯和氨基酸的量比普通的大曲要多[7-9]。對于大曲來說，糖化力和液化力指標比較重要[10-12]，因為關系到原料的糖化結果，與酒的出酒率有直接關系，所以對于液化淀粉酶和糖化淀粉酶的研究較多，其他水解酶則對白酒的香味物質的生成或前體物質的生成有重要的貢獻[13-16]。

研究了貴州某企業所生產的大曲中各種酶及酶活力與白酒品質的關系，為后續改良大曲的質量，提高酒品質和減少大曲用量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型大曲：貴州某企業提供。豆餅粉、麩皮：河南省臺前縣興隆面粉有限公司提供。氣相色譜所用試劑均為色譜純，其他試劑和藥品均為分析純。

1.2 儀器及設備

UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；6890N氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 酸度的測定

稱取5.0g絕干曲，置于250mL燒杯中。加水100mL，搖勻，于25℃浸泡30min，緩慢攪拌。經過濾，得濾液備用。取濾液10mL，于250mL三角瓶中，再加水20mL，滴1%酚酞指示劑2滴，0.1mol/L NaOH溶液滴定至微紅色。酸度計算公式：

式中：C為NaOH溶液的摩爾濃度，mol/L；V為消耗NaOH溶液的體積，mL ；為100mL浸出液取10mL浸出液；10 5為5g曲換算成10g曲。

1.3.2 糖化力的測定

酶浸出液及糖化力測定試液制備：在250mL燒杯中加入蒸餾水90mL，再稱取5.0g絕干曲粉加入燒杯中，在30℃條件下水浴1h，每隔15min攪拌一次，之后用定性濾紙過濾，最初的5mL濾液棄去，剩下的濾液4℃保藏。

在100mL容量瓶中吸取2%可溶性淀粉溶液50mL，35℃水浴20min，再加入10mL酶浸出液，搖勻后準確計時，反應1h后加入1mol/L的NaOH溶液3mL，待其停止反應，反應液至室溫后用蒸餾水定容，此時的溶液為堿性。

空白試驗液：在100mL容量瓶中吸取50mL 2%可溶性淀粉溶液，先加1mol/L NaOH溶液3mL，搖勻后加入10mL酶浸出液，之后用蒸餾水定容。

糖分測定：在250mL三角瓶中吸取5mL糖化液，再分別加入5mL費林氏甲、乙液，再加適量0.1%標準葡萄糖溶液，搖勻，之后在電爐上加熱至沸，立即用標準葡萄糖溶液滴定，直到藍色消失。滴定需要在1min內完成，滴定所消耗葡萄糖的體積為V1。

空白試驗液的測定：用5mL的空白液代替糖化試液，其他操作與樣品處理相同，葡萄糖消耗體積為V0。

糖化力的定義：1g絕干曲在35℃、pH4.6條件下反應1h，將可溶性淀粉分解后葡萄糖的質量（mg）數，U/g。糖化力計算公式：

式中：V0為5mL空白液消耗0.1%標準葡萄糖液的體積，mL；V1為5mL糖化液消耗0.1%標準葡萄糖液的體積，mL；ρ為標準葡萄糖溶液濃度，g/mL；為5g干曲浸出后在100mL溶液中取出10mL進行糖化試驗；為100mL糖化液中取5mL定糖；1 000為換算系數。

1.3.3 液化力的測定

5%酶液的制備：取500mL燒杯，稱取10g絕干曲粉加入其中，將200mL磷酸緩沖液（pH 6.0）在40℃條件下預熱，然后加入燒杯中，并在水浴鍋中保溫1h，每隔15min攪拌1次，等浸泡時間結束后用定性濾紙過濾，最初的5mL濾液棄去，濾液即為供試酶液。

液化力的定義：1g絕干曲在60℃，1h液化可溶性淀粉的質量（g）。

液化力測定：用移液管取2%可溶性淀粉溶液20mL于25mm×200mm的具賽試管中，再加入5mL磷酸緩沖液（pH 6.0），在60℃條件下水浴10min，之后吸取1mL酶浸出液加入試管中搖勻，立即計時。在白瓷板中加入1.5mL稀碘液，每隔一定時間吸取0.5mL反應液于白磁板孔中，隨著時間的延長，白瓷板中的顏色逐漸由藍色變為紅棕色，以最后一次呈藍色為終點，樣品做2個平行實驗。最初取反應液的間隔時間可長些，當顏色接近終點時須仔細檢查，至沒有藍色為反應終點。要求樣品與酶液的反應在2～3min內完成為宜，否則需要調整酶液濃度后重新測定，酶液總體積以v表示，反應時間為t。液化力計算公式：

式中：20為2%可溶性淀粉溶液的體積，mL；60為時間換算系數；v為測定時所用酶液總體積（1mL）；t為反應時間（2min）。

1.3.4 酯化力的測定

酯化液制備：取0.1%己酸體積分數20%的乙醇溶液100mL于250mL蒸餾燒瓶中，稱取5g干曲于燒瓶中，在32～35℃條件下酯化100h，之后再加入50mL蒸餾水，加熱蒸餾，當蒸餾液為100mL時測定餾出液中己酸乙酯的含量。

酯含量測定：用移液管吸取餾出液50mL，之后用0.1mol/L NaOH中和至酚酞的終點，再吸取25mL 0.1mol/L NaOH溶液加入其中，沸水浴回流皂化30min，待其冷卻后用0.05mol/L H2SO4滴定，當酚酞紅色消失時為滴定終點。酯化力計算公式：

式中：C1、C2分別為NaOH和H2SO4的濃度，mol/L；V1、V2分別為NaOH和H2SO4標準溶液的體積，mL；m為干曲質量，g ；為從蒸餾液100mL中取出50mL測酯含量；144為己酸乙酯的換算系數。

1.3.5 蛋白水解力的測定

0.5 %干酪素溶液液的制備：稱取干酪素0.5g（準確至0.000 1g）放入燒杯中，加水50mL，NaOH溶液10mL，攪拌均勻，加熱至沸，溶解、冷卻，加入酚酞指示劑3滴，滴加鹽酸溶液中和至微紅色消失（約8mL），加檸檬酸鈉溶液7.5mL，移入1 000mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻；若隔日使用，加甲苯少許，放入冰箱中保存，以防微生物滋長。

5%樣品溶液的制備：稱取相當于5g絕干曲（稱準至0.001g），移入100mL容量瓶中，搖勻，定容至刻度，在40℃水浴中，間斷攪拌1h，過濾備用。

測定：取試管10支，按順序編號，依照下表各試管規定量，分別加入0.5%干酪素溶液，5%樣品溶液和蒸餾水，混勻。各試管同置于40℃水浴中，保溫60min。取出各試管，分別加入硫酸鎂硝酸溶液0.5mL，混合均勻，放入試管架上靜置1h，觀察各試管以不生成沉淀者為蛋白質分解已完全的標志，即生成沉淀的試管前的一個沒有生成沉淀的試管為蛋白質剛好完全分解的臨界值管，記錄臨界值管中5%樣品溶液的體積a。蛋白分解力計算公式：

式中：0.5/100×5為干酪素溶液的稀釋倍數；5/100為樣品溶液的濃度，%；a為臨界值試管中大曲浸出液的體積，mL。

1.3.6 白酒中各項指標的檢測

按照GB/T10345—2007《白酒分析方法》進行。

2 結果與分析

2.1 酒質的測定

針對企業基酒酒質發生變化，尤其是酒體中乳酸乙酯含量升高，己酸乙酯含量下降，高級醇含量減少的現況。對全年酒質分析的結果表明（見表1），己酸乙酯與乳酸乙酯含量之比平均為0.65，主體香味不突出，酒體淡薄。

表1 酒體中己酸乙酯與乳酸乙酯的比值Table 1 Ratio of ethyl hexanoate and ethyl lactate in liquor

為了提高產率與產品質量，降低生產成本。對大曲的質量，進行檢測，并針對其質量，采用酶制劑加以改良，從而達到保證質量、提高產量的目的。

2.2 大曲中糖化酶的產生及其與酒質的關系

白酒生產是以大曲為糖化發酵劑，名優酒大曲的糖化力往往在250～500mg/（g·h），而某企業生產的大曲糖化力一般均在750mg/（g·h）左右，且酸度較大。制曲前期的曲塊中細菌和酵母的數量占優勢，但是隨著品溫的升高，大量微生物的衰亡或生長受到抑制，數量急劇下降，這種生長優勢發生改變。與細菌和酵母不同的是，在制曲前期，霉菌的生長速度比較緩慢，在培養5d后進入對數期，當培養8d后到達對數生長末期，以后進入穩定期，而其中大量的霉菌為根霉。根霉的糖化酶活力最高，除此而外還有黑曲霉和紅曲霉也是糖化酶的產生菌。

根霉所產的酸主要有3種：即乳酸、延胡索酸和蘋果酸。有些根霉只產乳酸，有些只產延胡索酸，有些不僅產乳酸而且還產延胡索酸而有些則這3種酸都產。但在以往的研究中發現只產延胡索酸和蘋果酸的根霉對濃香型白酒的品質無明顯的影響[17]。

在根霉的糖酵解途徑中產生延胡索酸，在細菌或酵母代謝中，由延胡索酸酶催化為L-蘋果酸，但隨著蘋果酸的大量累積，并在乳酸菌存在的條件下，會進行蘋果酸-乳酸發酵，終產物中L-乳酸和CO2的含量較高，并含有少量的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH2）和丙酮酸。

表2 不同糖化力的大曲試驗結果Table 2 Experimental results of different diastatic power of Daqu

大曲中的根霉在提供了高的糖化力的同時也產生了大量的乳酸，造成大曲pH值下降，當發酵時乳酸和乙醇會發生酯化反應，生成乳酸乙酯，使得白酒中的含量增加。

以下是用不同糖化力的大曲生產試驗，結果見表2。

由表2結果可知，糖化力高的大曲應用于生產，雖然出酒率略有升高，但由于乳酸乙酯含量過高，這使得酒體發悶，有強烈的青草味，從而影響了酒的品質。

2.3 大曲中蛋白酶的作用與影響

蛋白水解酶是催化多肽或蛋白質水解的酶的統稱，簡稱蛋白酶。蛋白酶對機體的新陳代謝及生物調控起重要作用。蛋白酶可以將大分子的蛋白質降解為小分子的多肽或者更小的分子氨基酸等物質。如果在大曲中缺乏蛋白酶或者是酶活力較低，則對酒質的影響比較明顯，造成酒體質量偏低。

在白酒中雜醇油含量主要與支鏈氨基酸有關，蛋白質分解成氨基酸再進一步水解放出氨、脫羧基，生成醇。除異丁醇和異戊醇外，還有戊醇、丙醇、異丙醇、庚醇等。酵母在代謝途徑中能夠產生脫氨和脫酸酶類，這些酶可以使苯丙氨酸轉化成β-苯乙醇，色氨酸轉化成色醇，酪氨酸轉化成酪醇等。因此大曲中的蛋白酶含量的多少或者活力的高低，決定了蛋白質降解的程度，這也決定了高級醇含量的多少。

表3 窖泥中氨基酸含量與酒體中雜醇油、己酸乙酯含量關系Table 3 Relationship between amino acid content in pit soil and fusel oil,ethyl caproate content in liquor

氨基酸不僅與高級醇的生成有關，而且其含量與己酸乙酯生成的量呈正比，為考查窖泥中氨基酸含量與酒體中雜醇油、己酸乙酯含量關系，隨機抽取9個樣，結果見表3。

從表3結果可知，窖泥中氨基酸含量越高，酒體中的雜醇油和己酸乙酯含量也越高。一些可溶性氨基酸滲入窖泥內，為己酸菌繁殖生長提供了營養源，促進了己酸菌的發酵，從而產生更多的己酸。

據此原理可以推斷，氨基酸含量的增加有利于酯的生成。

酒體中重要風味組份包括含硫有機物，比如二甲基硫、二甲基二硫的生成與半胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸的存在有關。即使含硫有機物的含量很少，可是由于其閾值極小，從而對白酒風味產生了一定的影響，特別是名優酒中含量較高。

表4 大曲中蛋白水解酶活力高低與酒質的關系Table 4 Relationship between proteolytic enzyme activity and liquor quality

大曲中蛋白水解活力不同對酒質產生較大的影響見表4。

表4結果表明，大曲中蛋白水解酶活性高，酒體中的高級醇、己酸乙酯含量高，酒體醇厚，主體香味突出。

2.4 大曲中酯化酶活力對酒質的影響

己酸乙酯含量的高低及與其他酯類物質（乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯等）的比例關系決定酒質的優劣，這是判定濃香型白酒酒質優劣的重要指標之一。根據酯化反應的原理，在生產濃香型白酒時，為提高白酒中己酸乙酯的含量，一般采用的是分離并篩選產己酸含量較高的菌株，在此基礎上優化其培養工藝，提高在窖內的己酸含量。并且有時在改造窖池時，為穩定己酸的含量，在其中加入己酸菌液，以提高酒醅中己酸含量，從而達到提高酒體中己酸乙酯含量的目的。但酯化反應速度較慢，所以在有限的時間內，轉化成酯的速率比較低。目前一般利用酯化酶催化技術，就是將己酸和乙醇用酯化酶催化生成己酸乙酯，使其含量明顯升高。在形同的條件下，在大曲中加入2%酯化酶進行發酵實驗，此時酯化酶的活力為236mg/（g·100h），其結果表明，實驗窖中的己酸乙酯含量比對照窖中的要高，其分別是5.37g/L和3.26g/L（底糟），表明增加酯化酶能提高己酸乙酯含量。

酯化酶能夠在水相中水解脂肪，可將酒醅中的脂肪水解為甘油和脂肪酸，脂肪酸能夠與乙醇酯化生成油酸乙酯、亞油酸乙酯和棕櫚酸乙酯等高級脂肪酸，同時，在固態發酵條件下，酯化酶催化己酸、乳酸等小分子酸與乙醇作用，生成己酸乙酯、乳酸乙酯等風味物質，所以酯化酶的存在，對酒的風格的形成，起到舉足輕重的作用。

3 結論

綜上所述，大曲的生化性能，對酒質的優劣和白酒產量的高低有著決定作用。大曲糖化力高，而蛋白水解酶、酯化酶活力低，長期使用，質量和產量出現下降的趨勢，這是必然的結果。因此保證大曲的質量，生產優質大曲，是釀造優質的白酒的前提條件。

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