兩種生產用米曲霉的形狀及蛋白酶性質研究

曾小波，劉 瀅，朱新貴，李 理*

（1.李錦記（新會）食品有限公司，廣東 江門 529156；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640）

醬油釀造過程中，菌種的作用至關重要。目前國內大多數醬油生產廠家所用的菌種為滬釀3.042及從該菌種誘變篩選而來的菌種。滬釀3.042具有生長快、蛋白酶活力較高、產孢子量大、抗雜菌等優點，但其蛋白酶活力仍然不夠高，且以中性和堿性蛋白酶為主，酸性蛋白性較弱，導致蛋白質利用率保持在75%左右的水平。而日式醬油，由于其菌種技術的發展，其蛋白質利用率已達到92%的水平[1]。因此菌種的選育和研究對醬油生產企業有極其重要的作用。

本企業在長期的生產實踐過程中，從最初的米曲霉3.042中不斷地誘變篩選，獲得了兩個各具優點、性狀不同的菌株。為了對這兩株菌種有系統的認識，從而為生產控制提供數據支持，并為進一步篩選優良菌種提供理論依據，研究比較了2株米曲霉的基本性狀，同時分析了成曲粗酶液中蛋白酶的酶學性質，研究結果可用于企業生產。

1 材料與方法

1.1 主要材料

米曲霉1號、米曲霉2號：生產用種，從滬釀3.042米曲霉中篩選獲得。

種曲、成曲：李錦記（新會）食品有限公司車間提供。

察氏培養基：購于廣東環凱微生物科技有限公司。

雙層酪蛋白培養基：底層：瓊脂粉15g，加蒸餾水1 000mL，煮沸溶解后于121℃滅菌20min，每個平皿加約8mL；上層：Na2HPO4·12H2O 1.07g，KH2PO40.36g，BaCl25.0g，酪蛋白4.0g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL。配制時，酪蛋白先用20mL溶解，再與900mL水及除BaCl2外的其他藥品混合。BaCl2則用100mL水單獨溶解，各自在121℃滅菌20min，使用前混合。上層培養基每個平皿定量8mL。

豆汁培養基：5°Bé豆汁1 000mL，硫酸鎂0.5g，可溶性淀粉20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸銨0.5g，瓊脂20g，pH6.0，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設備

XSP-8C光學顯微鏡：上海繪統光學儀器廠；UV-1100可見分光光度儀：北京萊博泰科儀器有限公司；SL1545恒溫培養箱：東南化學儀器有限公司；0～200mm游標卡尺：中國機械進出口公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌落形態觀察

察氏培養基和豆汁培養基倒平板后，將孢子稀釋涂布于平板，倒置于培養箱中31℃培養，每隔一段時間觀察菌落形態，并測定菌落的直徑。

1.3.2 顯微鏡觀察

載玻片培養觀察法：將察氏培養基滅菌后冷卻至45℃左右，接入適量米曲霉孢子，搖勻后，迅速取培養基于無菌載玻片上，蓋上蓋玻片，將載玻片放入無菌平皿中，然后置于30℃恒溫培養箱中培養，每隔一段時間將載玻片取出，在顯微鏡下觀察菌絲生長情況[2]。

1.3.3 產酶能力

將雙層酪蛋白培養基倒入平皿后，將稀釋后的孢子涂布于平皿，倒置于培養箱中培養，每隔一段時間測定菌落直徑d1和透明圈直徑d2，計算K值（K=d2/d1）。

1.3.4 酶學性質研究

最適酶促反應溫度：在pH7.2，不同溫度條件下（溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）測定蛋白酶活力。

最適酶促反應pH：配制不同pH值的磷酸鹽緩沖液和乳酸鹽緩沖液。在40℃，不同pH條件下（pH值為3、4、5、6、7、8、9、10）測定蛋白酶活力。

不同鹽含量條件下的粗酶蛋白酶活力：在40℃，pH7.2的條件下，測定粗酶酶液在不同鹽含量條件下（鹽含量分別為0、5%、10%、15%、20%、25%）的蛋白酶活力。

1.3.5 測定方法

樣品處理：將待測樣品混合均勻，稱取10g樣品于研缽內，先加入蒸餾水20mL，靜止浸泡10min，然后小心將每顆成曲表皮磨下，倒入250mL三角瓶內，加入蒸餾水使三角瓶內樣品加水的質量共100g，搖勻，置于40℃水浴間斷振搖1h，取出搖勻后過濾，此濾液用緩沖液稀釋5倍，即制得稀釋50倍的提取液，備用。

采用福林法蛋白酶活力測定，按SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》進行測定，在40℃、pH7.2條件下每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸，定義為一個蛋白酶活力單位。淀粉酶活力測定參考3，5-二硝基水楊酸法[3]測定，在40℃條件下每分鐘水解淀粉產生1mg麥芽糖，定義為一個淀粉酶活力單位。果膠酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸法[4]測定，1mL酶液在50℃、pH3.5的條件下，1h分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

2 試驗結果與分析

2.1 形態特征

2.1.1 菌落形態

將兩株米曲霉分別稀釋一定倍數涂布在察氏平板和豆汁平板上，置于31℃培養3～5d。米曲霉的菌落形態描述見表1。

表1 兩株米曲霉的菌落形態比較Table 1 Colony morphology of two strains of A.oryzae

由表1可知，兩株米曲霉的菌落在顏色以及形態上均有差異。

將兩株米曲霉孢子稀釋到一定倍數后分別涂布在豆汁平板培養基上，置于不同的溫度條件下培養，每天觀察米曲霉生長情況，并測定菌落直徑，結果見表2。

由表2可知，在同一時間，米曲霉1號的菌落都比米曲霉2號的菌落大，由此可以推出米曲霉1號比米曲霉2號生長得快。由表2還可以得知，兩株米曲霉均在31℃、36℃時生長速度較快，溫度過高（41℃）時，米曲霉不生長，而溫度較低時（26℃），米曲霉生長緩慢。

2.1.2 細胞形態

利用載玻片培養法觀察米曲霉不同生長階段的顯微形態，結果見表3。

由表3可知，米曲霉的生長大致可分3個階段：孢子發芽期、菌絲生長期和產孢子期。兩株米曲霉的孢子均近似圓形，頂囊呈燒瓶形，小梗單層，孢子穂呈掃帚形或半球形。兩者的區別是：米曲霉1號發芽較米曲霉2號快，產孢子也較早，這與2.1.1得到的結果相符。此外，米曲霉1號的孢子呈線狀排列，延伸較長，表現為成曲時孢子較多，而米曲霉2號的孢子囊成簇擁狀，孢子較少。

表2 不同溫度下兩株米曲霉的生長情況比較Table 2 Growth states of two strains of A.oryzae under different temperature conditions

表3 米曲霉不同生長階段的細胞形態Table 3 Cell morphology in different growth stages of two strains of A.oryzae

2.1.3 種曲形態

兩株米曲霉制成的種曲見圖1。

觀察種曲形態（圖1）可知，米曲霉1號種曲呈黃綠色（偏黃），菌絲較短，結塊較少，孢子多；米曲霉2號種曲呈黃綠色（偏綠），菌絲較長，易結塊，孢子多。

2.1.4 成曲形態

兩株米曲霉制成的黃豆成曲見圖2。

觀察成曲形態（圖2）可知，米曲霉1號成曲黃綠色，孢子較多，菌絲較短；而米曲霉2號菌絲較長，孢子較1號少，顏色比1號白。

圖1 兩株米曲霉的種曲形態Fig.1 Koji morphology of two strains of A.oryzae

圖2 兩株米曲霉的成曲形態Fig.2 Mature koji morphology of two strains of A.oryzae

2.2 平皿產酶能力的對比

兩株米曲霉在雙層酪蛋白培養基中培養48h、60h、72h、84h時，分別測定菌落直徑d1及透明圈直徑d2，并計算菌種的K值（K=d2/d1），結果見表4。

表4 兩株米曲霉在酪蛋白平板上K值的比較Table 4 K values of two strains of A.oryzae in casein plate

由表4可知，米曲霉2號的菌落直徑遠小于米曲霉1號，但其K值明顯大于米曲霉1號。根據文獻[5-6]，K值和菌落直徑的大小共同決定了米曲霉蛋白酶活力的高低，當菌落直徑相近時，K值大的產蛋白酶活力高；而當K值相近時，菌落大的產蛋白酶活力高，但哪個因素對蛋白酶活力影響更大并未提及。張玉濤等[7]對多株米曲霉的菌落直徑（D）和K值對蛋白酶活（U）的影響進行回歸分析，得出這樣一個關系：U=1.30K+0.032D-1.26。這個公式在一定程度上說明了K值對蛋白酶活力影響更大。根據實驗測定及生產數據，發現米曲霉2號的蛋白酶活力始終大于米曲霉1號，這進一步說明K值對蛋白酶活的影響更大。因此，在利用酪蛋白平板對菌種進行初篩時，應首先考慮K值大小，其次再考慮菌落大小。

2.3 不同酶的活力比較

表5 兩株米曲霉不同酶的活力比較Table 5 Different enzyme activity of two strains of A.oryzae

由表5可知，曲培養44h后，兩株米曲霉的淀粉酶酶活力差異較小，米曲霉2號要稍低于米曲霉1號，而果膠酶和蛋白酶活力則是米曲霉2號高于米曲霉1號，其中蛋白酶活力要遠遠高于米曲霉1號。這說明，在酶活力方面，米曲霉2號更有優勢。

2.4 成曲蛋白酶性質對比

2.4.1 兩株米曲霉產酶活力的周期

在制成曲時，開始0～20h不取樣，在20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h時抽樣檢測中性蛋白酶活力，作出不同時間的酶活力關系曲線，找出最高中性蛋白酶酶活力的大致時間段，結果見圖3。

圖3 成曲制作過程中的蛋白酶活力變化Fig.3 Variation of protease activity in the process of mature koji production

由圖3可知，隨著培養時間的延長，成曲的蛋白酶活力呈逐漸上升的趨勢，到達一定值后趨于穩定或略微下降。米曲霉1號和2號的成曲均在培養40h左右，蛋白酶活力達到最大值，但米曲霉2號的最大酶活力遠遠高于米曲霉1號。

2.4.2 不同pH條件下成曲蛋白酶活力的曲線

配制pH3～10的磷酸鹽緩沖液或乳酸鹽緩沖液。按照福林法步驟測定酶活力，結果見圖4。

從圖4可知，米曲霉2號明顯比1號的蛋白酶活力高。在pH3～7的區間，米曲霉2號的酶活力上升較明顯，在pH7左右有一個酶活力峰，而后開始緩慢下降，至pH9時有最高酶活力峰，說明米曲霉2號成曲蛋白酶多為堿性蛋白酶。而米曲霉1號在大約pH6的時候有最高峰，pH9時也有一個酶活力峰，但較pH6低，說明米曲霉1號菌的最適反應pH值為6，其堿性蛋白酶相對較弱。以上說明這兩個菌株是米曲霉的不同菌株，兩個菌株在蛋白酶活力的最高峰值的pH值不同，且蛋白酶活力的值相差較大。與前期觀察結果相符合。

圖4 成曲不同pH條件下測定的蛋白酶活力Fig.4 Protease activity of mature koji under different pH conditions

2.4.3 不同溫度條件下成曲蛋白酶活力的曲線

圖5 成曲在不同溫度下測定的蛋白酶活力Fig.5 Protease activity of mature koji under different temperature

由圖5可知，在35～60℃之間，隨著溫度的升高，兩株米曲霉的成曲蛋白酶活力均先升高后降低，但米曲霉1號的最適酶促反應溫度為45℃，米曲霉2號的最適酶促反應溫度為50℃，且2號的酶活遠高于1號。

2.4.4 成曲蛋白酶的耐鹽曲線

圖6 成曲在不同氯化鈉濃度下測定的蛋白酶活力Fig.6 Protease activity of mature koji under different sodium chloride concentration

由圖6可知，隨著鹽分含量的增高，兩株米曲霉的成曲蛋白酶活力均逐漸降低，在20%氯化鈉條件下，蛋白酶活力均降至無鹽條件下的20%～30%。但米曲霉2號的蛋白酶活力在不同的鹽分含量下始終是米曲霉1號的2倍多。

3 結論

由米曲霉形態特征及蛋白酶性質等方面的比較可知，2株米曲霉是不同的菌株，有著明顯的差異。米曲霉1號菌落較大、發芽和產孢子較快，種曲及成曲顏色偏黃，菌絲較短，孢子較多；而米曲霉2號菌落較小，孢子發芽時間及產孢子時間比1號晚，成曲孢子較1號少，但菌絲長且粗壯，種曲顏色偏綠，成曲顏色偏白。米曲霉2號的產酶能力強。

蛋白酶性質的研究結果顯示，成曲的蛋白酶性質有差異，1號和2號的最適反應溫度分別為45℃和50℃，最適反應pH分別為6.0和9.0。在生產應用過程中，兩菌株各有優缺點，其生產性能同其形態和酶學性質等有密切的相關性，因此對兩株菌種的基本性狀及酶的研究對企業生產極為重要。

本研究僅從基本的微生物形態和酶活力等方面進行實驗，在分子生物學、基因層面還有待進一步研究。

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