多菌種復合制曲技術研究

林 汲，趙紅年*

（山西梁汾醋業有限公司，山西 太原 030032）

傳統山西老陳醋大曲原料為大麥和豌豆，制曲過程中微生物主要來源于原料和制曲環境，包括霉菌、酵母菌、醋酸菌、芽孢菌等，傳統制曲法主要依靠環境中的微生物自然選擇形成特定的群落，進而代謝產生酶系[1]。由大麥和豌豆所構成的大曲其營養成分不能滿足更多種類微生物的棲息、生長，且傳統方法所富集的微生物不具有定向選擇性，對原料的利用率不高，亦對食醋品質的穩定性有一定的影響[2]。

本研究在傳統制曲原料的基礎上，加入一定比例的麩皮、蕎麥和綠豆，并分離出制曲過程中的優勢菌種，經誘變、擴培、接種至復合曲的制備過程中，經多種微生物菌群的協同發酵，提高了復合曲中的特定酶活，為釀造高品質多香型食醋奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥、豌豆、蕎麥、綠豆（要求顆粒飽滿，無病變，無霉變）均購于山西三盟實業發展有限公司；麩皮（購于古船面粉（晉中）有限公司）；飲用純凈水：自制。

葡 萄 糖、NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、乙酸鈉、葡萄糖、硫酸鎂、硫酸錳均購自國藥集團化學試劑公司。

霉菌分離培養基—馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar medium，PDA）培養基[3]：馬鈴薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，瓊脂20.0g/L，自然pH值，121℃滅菌20min。

酵母菌分離培養基酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基[4]：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，瓊脂20.0g/L，115℃滅菌30min。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外分光光度計：日本島津公司；pHS-3C型精密酸度計：上海精密儀器有限公司；SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；LHS-250SC恒溫恒濕培養箱：上海博訊實業有限公司；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；GZC-9140MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司；CX21顯微鏡：日本奧林巴斯公司；TE124S分析天平：德國賽多利斯；HZQ-A氣浴恒溫振蕩器：常州中誠儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

將曲塊研細成粉，稱取25.0g于225mL無菌生理鹽水中，用玻璃珠打散，浸泡30min。取1.0mL上清液加入9.0mL無菌生理鹽水中，配制成10-2菌懸液。依次類推，配制成10-3～10-7的菌懸液。分別吸取0.2mL稀釋度為10-3～10-7的菌懸液，均勻涂布于已冷卻至室溫的平板培養基上，每個稀釋度做3個平行樣。將接種好的平板置于36℃恒溫培養箱中培養3～5d[5]。

1.3.2 菌種誘變

參照劉慶玉等[6]試驗方法，菌懸液先用30W紫外線照射60s，然后再用濃度為0.2mol/L的亞硝酸處理20min，誘變菌株經培養后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時取對應的菌株活化后接種至250mL搖瓶中，30℃、180r/min搖床發酵培養48h，對發酵液進行分析并選取優勢菌株。

1.3.3 菌種拮抗試驗

將各菌株做拮抗試驗，2種不同的菌在平板上劃線但不相交，觀察是否有拮抗，抑制孢子的生成等現象[7-9]。

1.3.4 種曲制備

5種原料混合、篩選、粉碎，然后加水，加水量為原料總重量的0.5～0.6倍。將不同高產菌種各取2～3環，接入裝有種曲原料的三角瓶中進行培養（pH6.0～7.0，溫度32～34℃，時間46～48h），之后繼續擴培，制得種曲。

1.3.5 多菌種復合曲制備工藝流程

（1）配料

根據本研究中主要微生物的產酶能力，大麥、豌豆、麩皮、蕎麥、綠豆按照特定比例進行組配，水的質量為上述原料總質量的0.5～0.6倍。

（2）接種

拌勻后的曲料接種預先培養好的種曲，充分翻拌。

（3）堆積

曲料堆積高度50cm，溫度33～34℃，時間24～36h，以使孢子吸水膨脹、發芽。

（4）發酵控制

根據復合曲的品溫來進行通風，以保持其品溫在32～34℃范圍內，并根據菌種生長的時期和特性對復合曲的水分進行補償或減少。

（5）復合曲成曲

菌絲生長衰退，呼吸已不旺盛，降低濕度，提高品溫至37～39℃，以排除水分，出房水分應控制在25%以下。

1.3.6 多菌種復合曲制備工藝優化

通過制曲溫度、種曲接種量、復合曲相對濕度和制曲時間4個因素來研究，以酯化力為試驗指標，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗進行優化。

1.3.7 質量鑒定方法

糖化力、液化力的測定方法依照文獻[10]方法進行；酯化力根據文獻[11]方法進行測定；蛋白酶活根據文獻[12]方法進行測定。

糖化酶活力（簡稱糖化力）定義：1.0g固態發酵產物在35℃、pH值為4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產生1.0mg葡萄糖，即為1個酶活力單位，U/g[13]。

液化酶活力（簡稱液化力）定義：1.0g固態發酵產物在60℃、pH值為6.0條件下，1h液化1.0g可溶性淀粉，定義為1個酶活力單位，U/g[13]。

酯化力（以乙酸乙酯計）定義：1.0g干曲在30～32℃反應100h所產生的乙酸乙酯毫克數，以mg/（g·100h）表示[14]。

蛋白酶活力定義：1.0g干曲在40℃、pH7.5的條件下，水解反應l.0min產生l.0μg 酪氨酸為1個酶活力單位，以U/g表示[14]。

2 結果與分析

2.1 制曲原料配比

山西老陳醋大曲的原料為大麥和豌豆，兩者的比例約為6∶4[15]，大麥含有較多的皮殼，纖維素含量高，淀粉含量約58%～65%[16]；豌豆蛋白質含量約21%～28%，淀粉含量低，黏稠性大，易黏結成塊[17]；麩皮碳水化合物含量約為61%，蛋白質含量16%[18]；蕎麥中氨基酸含量較為豐富，碳水化合物含量為73%[19]；綠豆中蛋白質含量約為干質量的22%，其微量元素亦較為豐富[20]，而且在制曲原料中添加綠豆，能夠賦予復合曲特殊的香氣。

根據山西老陳醋大曲、鎮江香醋小曲以及醬油曲中碳水化合物和蛋白質含量的比例，結合本研究多菌種生長代謝的基本要求，確定了復合曲原料最適配比為大麥30%、豌豆15%、麩皮10%、蕎麥20%、綠豆25%。

2.2 菌種選擇

經分離、誘變，選擇高產酶菌種，見表1。

表1 菌種選擇Table 1 Selection of strains

2.3 菌種間拮抗

菌種間拮抗作用見表2。

表2 不同菌種拮抗作用Table 2 Antagonistic effect of different strains

表2結果表明，所選擇的菌種之間不具有拮抗關系，因此可以將其接入制曲原料中。

2.4 單因素試驗

2.4.1 制曲溫度

固定多菌種復合曲相對濕度65%，種曲接種量3.5%，在不同溫度條件下培養72h，測定其酯化力。

圖1 溫度對多菌種復合曲酯化力的影響Fig.1 Effect of temperatures on multi-strains complex koji esterifying power

由圖1可知，制曲溫度對多菌種復合曲的酯化力影響較大。28℃時，酯化力僅為0.58 mg/（g·100h）；隨著溫度的上升，酯化力提高。34℃時，酯化力達到最高1.09mg/（g·100h）；34～40℃，其酯化力有所降低。分析原因為曲醅中微生物在高于最適生長溫度條件下，其生長代謝受到抑制，大部分菌種隨著溫度的增高而死亡，其代謝產生的酶系總量也有所降低。上述結果表明，制曲溫度不能波動太大，34℃制曲溫度較為適宜。

2.4.2 種曲接種量

固定多菌種復合曲相對濕度65%，溫度34℃，培養時間72h，不同比例接種后分別培養，測定酯化力。

圖2 種曲接種量對多菌種復合曲酯化力的影響Fig.2 Effect of inoculum size on multi-strains complex koji esterifying power

由圖2可知，種曲接種量與多菌種復合曲的酯化力呈正相關。隨著接種量的增加，多菌種復合曲的酯化力有所提高；2.5%～4.0%接種區間，酯化力隨接種量的增加而增加，4.0%～5.0%接種區間，酯化力趨于穩定。因此，4.0%的接種量較為適宜。

2.4.3 多菌種復合曲相對濕度

種曲接種量4.0%，多菌種復合曲相對濕度為50%、55%、60%、65%、70%、75%，34℃分別培養72h，測定其酯化力。

圖3 多菌種復合曲相對濕度對酯化力的影響Fig.3 Effect of multi-strains complex koji relative humidity on esterifying power

由圖3可知，多菌種復合曲的相對濕度對微生物的生長代謝也十分重要。接種后孢子發芽需吸水膨脹，隨著相對濕度的增加（50%～65%），其酯化力有所提高，但當相對濕度過高（大于65%）酯化力有所降低。分析其原因為多菌種復合曲相對濕度過高，嚴重破壞微生物胞內外滲透平衡，抑制了微生物的生長代謝，影響其產酶能力。因此，相對濕度65%較為適宜。

2.4.4 制曲時間

固定多菌種復合曲相對濕度65%，種曲接種量4.0%，在34℃條件下分別培養24h、36h、48h、60h、72h、84h、106h，測定其酯化力。

圖4 制曲時間對多菌種復合曲酯化力的影響Fig.4 Effect of preparation time on multi-strains complex koji esterifying power

由圖4可知，24～72h時，酯化力隨培養時間的延長而逐漸提高；72～106h時多菌種復合曲酯化力趨于恒定，說明在該時間段微生物群落結構及其生物總量趨于穩定，對原料的利用和代謝產生的酶系也趨于恒定。因此，制曲時間72h較為適宜。

2.4.5 多菌種復合曲制備條件優化

表3 多菌種復合曲制備條件優化正交試驗因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment for optimization of multi-strain complex preparation conditions

表4 多菌種復合曲制備條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of multi-strain complex preparation condition

表5 多種復合曲制備條件優化正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment for optimization of multi-strain complex preparation condition

由表4可知，對酯化力值影響的因素主次順序為制曲時間＞種曲接種量＞相對濕度＞溫度，最佳制備條件為A2B3C2D2，即制曲溫度34℃，種曲接種量4.5%，相對濕度65%，制曲時間72h。按上述優化條件制備多菌種復合曲，測得其酯化力平均值為1.14mg/（g·100h），高于正交試驗中各試驗組，為最佳制曲方案。由表5可知，影響多菌種復合曲酯化力的4個因素為D＞B＞C＞A，4個因素對結果均無顯著影響。

2.4.6 多菌種復合曲鑒定

表6 多菌種復合曲與大曲的理化性能比較Table 6 Comparison of physicochemical properties of multi-strain complex koji and Daqu

由表6可知，多菌種復合曲糖化力、液化力、酯化力及蛋白酶活均比大曲高。其中，糖化力提高14.63%，液化力提高15.09%，酯化力高23.91%，蛋白酶活性提高17.50%。說明多菌種的接入對復合曲糖化力、液化力、酯化力以及蛋白酶活力的提高起到直接的作用。

酯化力的提高將增加其發酵終產物食醋的香氣，蛋白酶活力提高將增加產品中氨基酸的含量，甘薯曲霉和黑曲霉分別具有高產纖維素酶和糖化酶的活性，能夠最大程度地將原料中的纖維素、淀粉分解為葡萄糖，為多群系多種類微生物的生長代謝提供了充足的能源。

3 結論

本研究將分離篩選到的發酵主體功能菌種進行了特定的高產酶誘變，并將其接種至復合曲的制備中，并根據特定微生物的代謝功能特點，在大曲制備原料的基礎上，加入麩皮、蕎麥和綠豆，進一步豐富了原料的營養成分，增加了多菌種復合曲的酶系。所得多菌種復合曲糖化力、液化力、酯化力以及蛋白酶活均有所提高，該研究為釀造高品質多香型食醋奠定了基礎。

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