納豆激酶高活性菌株BN-05鑒定及發酵工藝優化

王常蘇，孫曉彤，余 潔，高 冰*

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.武漢鑫宏食品釀造科研所，湖北 武漢 430051）

血栓性疾病可導致心肌梗塞、腦血栓中風、急性肺原性心臟病等相關性疾病[1]，因其發病率高、復病率高，而且難以根治，已成為威脅人類健康的主要疾病。因此，近幾年來就如何有效的治愈血栓性疾病，引起了醫學界、科技界高度重視。納豆激酶（nattokinase，NK）已被證明具有高效的溶栓作用[2-4]，其不僅可以直接降低纖維蛋白原，而且可以促進催化血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶，增加體內血栓溶解因子的合成[5-7]。相比臨床上的溶栓藥物（尿激酶（urokinase，UK）、鏈激酶（streptokinase，SK）和組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogenactivator，t-PA），納豆激酶具有高效的溶纖活性、安全性好、生產成本低、無毒副作用、半衰期長、在胃腸的穩定性好等優點[8-12]。

實驗對篩選的納豆激酶生產菌BN-05進行了菌落形態觀察和分子鑒定；并采用單因素和正交試驗對篩選菌株產納豆激酶的固體發態發酵條件進行了初步研究，以期提高納豆激酶的含量，為該酶的進一步擴大培養奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

菌種：納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus natto）BN-05，由本實驗室保存。柱式細菌DNAout（細菌基因組抽提試劑盒）：北京天恩澤基因科技有限公司。

1.1.2 培養基

初篩培養基：酪蛋白培養基，其組成為5g/L酪素，1g/L葡糖糖，1g/L酵母膏，1g/L K2HPO4，0.5g/L KH2PO4，0.1g/L MgSO4，pH7.0～7.2。

斜面培養基：LB培養基，其組成為10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L瓊脂，pH7.0。

液體種子培養基：10g/L葡糖糖，5g/L酵母提取物，10g/L牛肉膏，5g/L，pH7.4～7.6。

固體發酵培養基：黃豆洗凈，與水以1∶5（w/v）的比例混合。

1.1.3 主要試劑

纖維蛋白原標準試劑（88mg可凝蛋白/支）、牛凝血酶（560U/支）和尿激酶生物標準品（1 240IU/瓶）均購于中國藥品生物制品檢定所；瓊脂糖購自Biowest公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AvcmJ-E冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；FTGENE 5D PCR儀：英國Techne公司；Hitachi S-3000N 掃描電子顯微鏡（sanning electron microscope，SEM）：日本電子株式會社；UV-1800PC 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；SLY-2112B立式雙層大容量恒溫培養搖床：金壇市盛藍儀器制造有限公司；LHS-250SC 型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種鑒定

形態學鑒定：LB培養基培養菌株BN-05，為更清楚的觀察菌體形態和表面結果，對菌株進行掃描電子顯微鏡（SEM）觀察拍照。

16S rRNA菌株鑒定：用細菌DNA試劑盒（中國北京天恩澤基因科技有限公司）提取活性高菌株的基因組。PCR擴增采用通用引物：16sf95（TGACGAGTGGCGGACGGGTG）和16sr394（CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。擴增片段送華大基因公司測序，測序結果在NCBI網站利用Blast進行比對，調出相似序列，用MEGA5.0軟件構件系統發育樹[13-14]。

1.3.2 菌種生長曲線

將保藏的菌種轉接于新鮮的LB平板培養基上，活化24h，接入液體種子培養基（裝液量100mL/250mL）中，37℃、180r/min條件下培養，每隔2h取樣，測定波長660nm處的OD值，作出種子的生長曲線，確定接入發酵培養基的種齡。

1.3.3 固態發酵產納豆激酶酶的條件優化

固態發酵工藝：將精選的大豆進行清洗除雜，加入5倍的清水，20～25℃浸泡3～5h，瀝去水分，115℃滅菌30min，待其冷卻至35℃以下，按濕黃豆8%的接種量進行接種發酵培養，37℃靜置發酵48h，每隔12h攪拌一次。發酵結束后，提取粗酶液，用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定納豆激酶的活性。

產酶條件優化：通過碳源、大豆破碎度、接種量、發酵溫度進行單因素試驗，在單因素試驗的基礎上設計L9（34）正交試驗，確定最佳的發酵條件。每個試驗設計3個重復。

1.3.4 酶活測定方法

瓊脂糖-纖維蛋白平板的配制：按照Atrup法制備纖維蛋白原平板[15]并進行改進：首先將1%的瓊脂糖溶于0.05mol/L的Tris-HCl（pH7.8）緩沖溶液中，加熱至完全溶解后，取出10mL置于大試管中，待其冷卻至50℃左右，迅速倒入10mL 1.5mg/L牛血纖維蛋白原溶液，不斷振蕩，使其完全混合均勻，注入直徑9cm的培養皿中，再迅速加入300μL 20IU/mL的凝血酶溶液，不斷晃動平皿使三者混合均勻，防止氣泡的產生，靜置1h后，用直徑為2mm的無菌膠頭吸管在平板上打孔。

粗酶液的提取：將發酵好的納豆收集到離心管中（外粘物也一起收集），稱質量，向離心管中加入生理鹽水，納豆質量（g）∶生理鹽水（mL）=1∶2，4℃浸提4h后過濾，取濾液10000r/min離心15min，取上清液即所需要的粗酶液。

樣品測定：取粗酶液10μL點樣于瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37℃恒溫培養16h，測量溶解圈的直徑，計算各溶解圈面積，根據尿激酶標準曲線計算酶的活力單位。

2 結果

2.1 BN-05菌種鑒定

2.1.1 形態特征

菌落特征：經LB平板，37℃培養24h后，菌落圓形，邊緣不規則，白色，稍透明，中間凸起，表面皺褶，濕潤，用牙簽挑菌落有拉絲現象，菌落與培養結合緊密。

菌體形態：挑取單菌落革蘭氏染色后鏡檢，鏡下細胞形態為桿狀，革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生。菌的形態在SEM掃描電鏡下放大10 000倍的結果見圖1。

圖1 菌株BN-05的SEM形貌分析Fig.1 SEM analysis of strain BN-05

2.1.2 16S rRNA序列分析及系統發育樹的構建

PCR擴增所得BN-05菌株16S rRNA全長1513bp，序列已提交至GeneBank數據庫（序列號為KC703051）。BLAST分析結果顯示該基因同枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）的16S rRNA基因相似度達到99%。通過MEGA5.05軟件進行系統進化樹的構建，得到了系統發育樹狀圖見圖2。系統發育學分析結果表明，該系統樹以Paenibacillus borealis（AJ011322）作為一個單獨的外群種，其中BN-05菌株與Bacillus subtillis屬菌株在同一分支，結合菌株形態特征，初步鑒定BN-05為枯草芽孢桿菌屬。

2.2 種子生長曲線

種子是發酵的基礎，直接影響著固態發酵產納豆激酶的含量。將BN-05接入種子培養基，于37℃、180r/min條件下培養，每隔2h取樣，測波長660nm處的OD值，確定接入發酵培養基的種齡，結果見圖3。

由圖3可知，0～8h為延滯期，8～16h為生長對數期，16～28h為穩定期，從28h開始進入衰亡期。接種菌齡在對數生長期菌株存活率高且繁殖能力強，因此最佳接種齡為16h。

圖2 MEGA 5.05用鄰近法基于16S rRNA基因序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequence using MEGA version 5.05

圖3 BN-05 種子生長曲線Fig.3 Growth curve of the BN-05 seed

2.3 尿激酶的標準曲線[16]

配制不同的尿激酶標準品（200IU/mL、400IU/mL、800IU/mL、1000IU/mL、1200IU/mL、1400IU/mL、1600IU/mL、1 800IU/mL、2 000IU/mL和2 400IU/mL）各10μL點樣于新配制的纖維蛋白原平板上，放置10min，37℃培養16h后取出，測定溶解圈的直徑，計算各溶解圈面積，得出尿激酶活力的對數值（y）與溶解圈面積（x）呈線性關系，結果見圖4。

圖4 尿激酶標準曲線Fig.4 Standard curve of urokinase activity

由圖4可知，尿激酶標準線性方程為y=0.005 1x，相關系數R2=0.998 4。此標準曲線可用于測定納豆激酶的活性，根據納豆激酶溶解圈的面積，可計算出納豆激酶的活力單位。

2.4 固態發酵產納豆激酶的條件優化

2.4.1 不同碳源對發酵產酶的影響

以黃豆為基礎發酵培養，在基質黃豆滅菌冷卻后稱質量，按2%的量分別添加甘油、葡糖糖、木糖、蔗糖、可溶性淀粉，接種納豆枯草芽孢桿菌發酵，置于37℃的恒溫培養箱中培養48h，每隔12h攪拌一次，發酵完成后檢測納豆激酶的含量，結果見圖5。

圖5 不同碳源對納豆激酶的影響Fig.5 Effect of different carbon source on NK activity

以黃豆為單一的固態發酵基質，其蛋白質的含量比較高而碳水化合物的含量并不高，因此在基質中補加適量的碳源，可補充基質中碳水化合物的不足，提高納豆激酶的活力。由圖5可知，葡糖糖的添加可使納豆激酶的活力達到最大值為（3 310±110.23）IU/g濕黃豆，因此相對最佳碳源為葡糖糖。

2.4.2 大豆的破碎度對產酶的影響

為研究大豆破碎度對發酵產酶的影響，在其破碎度為0、2、4、6、8時，其他條件都相同的情況下進行發酵培養，發酵完成后測定樣品中納豆激酶的活性，結果見圖6。

圖6 大豆破碎度對納豆激酶的影響Fig.6 Effect of fragmentation of fermented soybean on NK activity

圖6表明，納豆激酶的活性隨著原料的破碎度不同而變化，當大豆的破碎度為4時，納豆激酶活性達到最大值，為（4 180±112.05）IU/g濕黃豆。

2.4.3 接種量對發酵產酶的影響

接種量的多少直接影響發酵過程菌株產酶的活力，研究其對發酵產酶的影響，在其他發酵條件不改變的情況下，分別按2%、4%、6%、8%、10%的接種量進行發酵培養，發酵結束后，測定納豆激酶的活力，結果見圖7。

圖7 接種量對納豆激酶的影響Fig.7 Effect of different inoculum size on NK activity

由圖7可以看出，接種量達到6%時，納豆激酶的含量較高，達到（3 560±105.43）IU/g濕黃豆。當接種量為2%～6%時，NK的活力呈增長趨勢，當增加為8%～10%時，NK的活力反而有所下降，這可能是接種量高容易造成前期消耗基質過多和基質缺氧，故選擇接種量為6%。

2.4.4 發酵溫度對發酵產酶的影響

選取發酵溫度分別為29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、40℃，在其他發酵條件不改變的情況下，考察溫度對納豆枯草芽孢桿菌產酶的影響，結果見圖8。

圖8 溫度對納豆激酶的影響Fig.8 Effect of different culture temperature on NK activity

溫度太低不利于菌株的生長，過高又不利于產酶，且酶在過高的溫度下極易失活。由圖8可以看出，培養溫度為35℃時，NK的活力相對較高，活力為（3 864±95.21）IU/g濕黃豆。因此菌株的適宜培養溫度為35℃。

2.4.5 發酵產酶條件優化

根據碳源、大豆破碎度、接種量和培養溫度這4個因素設計L9（34）正交試驗，確定最佳的發酵條件，因素水平見表1，試驗結果及方差分析表分別見表2和表3。

表1 固態發酵產酶正交試驗L9(34)因素水平Table 1 Factors and level of L9(34) solid fermentation producing NK orthogonal experiment

表2 固態發酵產酶正交試驗結果Table 2 Results of solid fermentation producing NK orthogonal experiment

表3 固態發酵產酶正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of solid fermentation producing NK orthogonal experiment

從正交試驗結果及方差分析表可以看出，4個影響因素對發酵產納豆激酶活力的影響因素主次為C＞D＞B＞A，其中C因素和D因素影響比較顯著，以黃豆為基質發酵納豆產納豆激酶的最佳發酵條件為C1D3B1A3，即大豆破碎度為2，發酵溫度為36℃，接種量為5.5%，葡萄糖為2.5%。在最佳的發酵條件下進行發酵試驗，3次試驗得納豆激酶活力的平均值為（4 715.26±103.23）IU/g濕黃豆，與之前相比（發酵條件優化前BN-05納豆激酶的活力為（1 991±93.87）IU/g濕黃豆），酶活性提高了137%。

3 討論

本研究對實驗室分離的納豆枯草芽孢桿菌BN-05進行了形態特征和分子生物鑒定，確定為枯草芽孢桿菌屬。對該菌株的發酵產納豆激酶的條件進行了探討和研究。單因素和正交試驗結果表明，該菌株產納豆激酶的最佳發酵條件：大豆破碎度為2，發酵溫度為36℃，接種量為5.5%，葡萄糖為2.5%。經過多次試驗驗證，采用此優化條件，BN-05的納豆激酶的活力為（4 715.26±103.23）IU/g濕黃豆，比之前提高了137%。本研究對納豆激酶的成品開發應用打下了基礎。

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