食醋中絮狀物產生菌的分離鑒定及檢測方法研究

薛建華，梁建明，王福中

（四川清香園調味品股份有限公司，四川 江油 621700）

我國釀醋歷史悠久，莊頒著《物原類考》有載“醬成于鹽，周時已有醋，一名苦酒，周時稱醯，漢始稱醋”[1]。近年來，食醋行業發展迅速，食醋品種不斷豐富，包裝容器除傳統的玻璃瓶之外，塑料瓶、塑料軟袋等也被廣泛應用。塑料包裝外觀多樣，且不易破碎，方便運輸，但其透氣性大于玻璃瓶，塑料材質尤其軟袋包裝的食醋中容易出現絮狀物，進而影響產品質量[2]，這一現象在食醋行業中普遍存在。對食醋中絮狀物的產生菌進行了分離鑒定，并確定了該菌的檢測方法，采用馬鈴薯液體培養基最快可在24h內對結果作出判定，能有效防止不合格品出廠，對指導食醋生產具有一定的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋：四川清香園調味品股份有限公司提供；馬鈴薯：市售；酵母膏、瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、碳酸鈣、無水乙醇（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

液體培養基：馬鈴薯汁1000mL，葡萄糖20g，pH5.5～6.0；

平板培養基：蒸餾水1 000mL，酵母膏10g，葡萄糖10g，無水乙醇20mL，碳酸鈣15g，瓊脂粉15～20g；

馬鈴薯汁制備方法：稱取去皮、切塊的馬鈴薯200g，加入1 000mL蒸餾水，煮沸20～30min，用多層紗布過濾，濾液加水定溶至1 000mL。

1.2 儀器與設備

SYQ-DSX-280A手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；EC3001生物顯微鏡：江西江鳳儀器科技有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；SW-CJ-1D單人單面凈化工作臺：蘇凈凈化設備有限公司；PHSJ-4A實驗室pH計：上海精密科學儀器有限公司；MJX-250B-Z培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 液體富集培養[3]

將配制好的液體培養基分裝于試管，每支試管9mL，塞上棉花塞，用牛皮紙包扎，于0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，冷卻備用。

在無菌操作下，取已經產生絮狀物的食醋1mL，不調pH直接接入液體培養基[4]，置于30℃培養箱中培養72h。

1.3.2 平板涂布培養

平板制備：準確稱取除無水乙醇外的其他培養基組分，配制后在0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，待培養基冷卻至45℃左右[5]，于無菌操作下加入無水乙醇，搖勻，傾倒平板，培養基凝固后備用。

涂布培養：在無菌操作下，將富集培養的菌液用滅過菌的生理鹽水，按照100、101、102的梯度進行稀釋，分別取0.2mL梯度稀釋的菌液至平板[6]，用涂布棒均勻涂布后置于30℃恒溫箱中培養4～7d。

1.3.3 平板劃線培養

平板制備：方法同1.3.2。

劃線培養：在無菌操作下，用接種環分別挑取涂布培養形成的單一菌落進行平板劃線，然后置于30℃培養箱中培養4～7d。

1.3.4 驗證試驗[7]

挑取劃線培養的純菌落再接入滅菌后的液體培養基中，于30℃培養箱中培養72h，觀察是否有絮狀物產生，從而篩選出目標菌。

1.3.5 初步鑒定

針對目標菌，根據《伯杰細菌鑒定手冊》[8]和《常見細菌系統鑒定手冊》[9]進行初步鑒定。

1.3.6 檢測方法優化

對葡萄糖、pH值及培養溫度3個因子進行L9（34）正交試驗[10]，找出食醋絮狀物產生菌的最佳檢測方法。

2 結果與討論

2.1 微生物的分離純化

通過液體富集培養、平板涂布及劃線培養，從產生絮狀物的食醋中得到A、B、C 3種微生物，其菌落形態見圖1。

圖1 分離出的三種微生物菌落形態圖Fig.1 Colonial morphology of three kinds of microbes isolated from vinegar

2.2 驗證結果

將A、B、C 3株菌分別接入滅菌后的液體培養基中，每組各接3支試管，于30℃培養箱中培養。C菌株在接種48h后3支試管均產生絮狀物，A菌株和B菌株培養96h后仍無絮狀物產生，因此確定C菌株為食醋中產生絮狀物的目標菌。

2.3 目標菌初步鑒定結果

對平板劃線培養的目標菌進行鑒定，其菌落小而突起，蒼白色，邊緣規則、整齊，光滑、濕潤，易于挑取；鏡檢菌體呈桿狀，單個、成對或成鏈；對照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》，結果見表1，初步鑒定該菌為葡糖桿菌屬（Gluconobacter）。可氧化乙醇得乙酸，但由于細胞中缺少琥珀酸脫氫酶，沒有完整的三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）途徑，因而不能將乙酸或乙酸鹽進一步氧化成CO2和H2O[11]。能通過己糖-磷酸鹽途徑分解代謝D-葡萄糖，并從D-葡萄糖產生2-酮基葡萄糖酸和5-酮基葡萄糖酸[12]。

2.4 檢測參數確定

為了縮短檢出食醋成品中是否存在絮狀物產生菌的時間，更好地指導生產，防止問題產品出廠，有必要對該菌的檢測方法進行優化。試驗在液體富集培養及單因素預試驗的基礎上，確定葡萄糖、pH值及培養溫度3個因子，每個因子選擇3個水平，進行L9（34）正交試驗，并根據液體培養基中絮狀物產生的時間進行記錄。因子水平表見表2，試驗結果與分析見表2、表3。

表1 絮狀物產生菌初步鑒定結果Table 1 Preliminary identification results of floccules strains

表2 絮狀物產生菌檢測條件優化正交因素與水平Table 2 Factor and levels of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

表3 絮狀物產生菌檢測條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Result and analysis of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

由表3所得極差R可知，對絮狀物產生菌檢測結果的影響依次為：葡萄糖＞培養溫度＞pH值；由表4可知，因子A影響極顯著，因子C影響顯著，因子B影響不顯著，因此，確定食醋中絮狀物產生菌檢測方法各因子的最佳水平為A3B3C2，即葡萄糖3g/100mL，pH值6.0，培養溫度28℃。

表4 絮狀物產生菌檢測條件優化正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

2.5 檢測方法驗證及確定

按照2.4中確定的參數配制馬鈴薯液體培養基，分裝于試管，每支試管9mL，塞上棉花塞，用牛皮紙包扎，于0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，冷卻備用。

在無菌操作下，取上述試管4支，其中3支接入有絮狀物的食醋，余下1支作為空白對照，接種后置于28℃培養箱中培養，觀察結果（圖2）：接有絮狀物食醋的3支試管均在24h內產生絮狀物；48h后絮狀物在液體培養基表面聚集形成凝膠膜[13]，當膜達到一定厚度便開始下沉，絮狀物繼續聚集然后在液體表面產生新的凝膠膜；空白對照無絮狀物、凝膠膜產生。由此確定食醋絮狀物產生菌的檢測方法如下：

圖2 24h、48h絮狀物和空白對比Fig.2 Comparison of floccules and blank after 24 h and 48 h

2.5.1 馬鈴薯液體培養基

馬鈴薯汁1 000mL，葡萄糖20g，pH值6.0；

馬鈴薯汁制備方法：稱取去皮、切塊的土豆200g，加入1 000mL蒸餾水，煮沸20～30min，用多層紗布過濾，濾液加水定容至1 000mL。

2.5.2 分裝、滅菌

每支試管裝入9mL馬鈴薯液體培養基，塞上棉花塞，用牛皮紙包扎，于0.15MPa蒸汽壓力條件下滅菌30min，冷卻備用。

2.5.3 接種培養

在無菌操作下，取食醋1mL不調pH，直接接入試管液體培養基中，搖勻，塞上棉花塞，置于28℃培養箱中培養。每組待測樣至少做3支試管，同時做空白對照。

2.5.4 結果判定

24h內，每組待測樣只要1支試管有絮狀物產生，而對照組無此現象，即可判定不合格；若待測樣的每支試管均無絮狀物產生，則繼續培養72h，每支試管均無絮狀物產生方可判定合格。

3 結論

從食醋中分離到的絮狀物產生菌為葡糖桿菌屬，其是醋酸菌科（Acetobacteraceae）的一個重要屬，與醋桿菌屬和葡糖酸桿菌菌屬菌株大多生長在富醇的培養基不同，葡糖醋桿菌屬菌株一般生長在含糖豐富的環境中[14]，可出現在花、園土、啤酒酵母、果實、葡萄酒、蘋果酒、啤酒、南非班圖酒、酒醋、軟飲料等[15]。采用馬鈴薯液體培養基，在葡萄糖3g/100mL，pH值6.0的條件下，于28℃培養最快可在24h內檢出，有利于指導生產，預防食醋尤其袋裝食醋貨架期出現絮狀物影響產品品質。

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