湖南民間酒釀中酵母菌多樣性的研究

閆華文，陳 璐，姚淑敏*

（曲阜師范大學生命科學學院，山東 曲阜 273165）

酒釀（sweet ferment rice）為江、浙、滬一帶的“白糟”，可習慣上稱為“香糟”，其味甘、性溫，可益氣、生津、活血、散結、消腫[1]。酒釀富含碳水化合物、蛋白質、B族維生素、礦物質等人體必需的營養成分[2]，具有健身、暖胃、維持腸道菌種平衡、美容等功效。其中B族維生素有促進乳汁分泌的作用，而少量的酒精具有促進血液循環，有助消化及增進食欲的功能[3]。酒釀種類繁多，其制作過程大致相同，都需要添加一種發酵劑，即酒曲。

近年來，隨著人們對酒釀的認識的提高，在不同的地區都有了酒釀的制作，并且各大商場都有銷售，即酒釀的制作有工業化的趨勢。但因傳統制酒釀條件簡單，受環境影響很大，不同地區制得的酒釀營養成分、微生物的組成也有所不同，這樣無法保證酒釀品質的穩定性，也無法保證酒釀中有效微生物的組成和數量，甚至可能含有害微生物[4]，從而導致酒釀制造過程的不可控性和質量的不穩定性。酵母菌包括釀酒酵母和非釀酒酵母[5]，是酒釀中主要的功能微生物之一。酒釀中酵母菌組成的研究，對提高酒釀的質量及進一步弄清其對酒釀品質的影響有重要意義。

酵母菌的常規鑒定主要依賴于形態和生理生化特征等表型特征，然而這些表型特征會隨著環境的變化有所改變，從而造成菌株鑒定結果的不穩定。隨著DNA分析技術的日漸成熟，利用rDNA鑒定菌種已經廣泛被應用[6-8]，特別是模式菌株的18S rDNA、26S rDNA的D1/D2區域很多已經被公布于GenBank/EMBL等國際核酸序列庫，這使酵母菌的分類鑒定更加快捷和準確。26S rDNA的D1/D2區域位于大亞基的5′端，序列長度在600bp左右，擴增常用通用引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3′。GUTEL LR R等[9]研究表明這段區域具有較高的變異率，可以用于親緣關系較近的菌株之間的分類研究。對大量子囊菌酵母模式菌種的26S rDNA的D1/D2的序列分析發現，同種內不同菌株D1/D2區核苷酸替換率一般不超過1%，而不同種菌株其核苷酸替換率一般較大，因此可以作為酵母菌種級水平鑒定指標。本實驗利用26S rDNA序列對所分離的酵母菌進行鑒定并結合生理生化特征探討了酒釀中酵母菌的多樣性，為酒釀的深加工提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒曲

酒曲：湖南韶山、湘潭、祁東民間酒曲。

1.1.2 培養基[10]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養基：葡萄糖1%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，瓊脂2%，用于分離酵母菌。

溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養基：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%，用于分子生物學鑒定。

碳基礎培養基：葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母粉0.02%，（NH4）2SO40.5%，KNO30.78%，分裝5mL/管。

氮基礎培養基：（NH4）2SO40.5%，NaCl0.01%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.1%，CaCl2·2H2O 0.01%，酵母粉0.02%，碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖）0.5%，分裝5mL/管。

醇類同化培養基：酵母膏0.01%，MgSO4·7H2O 0.025%，KH2PO40.05%，（NH4）2SO40.25%，分裝5mL/管+2滴醇（山梨醇、乙醇、甘油、赤蘚醇）。

糖發酵培養基：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1～2mL，pH7.6，分裝試管5mL/管+1mL糖（葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖、棉籽糖）+杜氏管。

1.1.3 其他

大腸桿菌DH5α：實驗室保存；氨芐青霉素，TaqDNA聚合酶，Dntp，10×buffer，2 000bp Marker，引物（NL1和NL4）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HNY-1102C 恒溫培養振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；A300型ArtGeneTM 基因擴增儀：杭州朗基科學儀器有限公司；StarPrep 膠回收試劑盒：北京康潤誠業生物科技有限公司；DYY-6C 瓊脂糖水平電泳板：北京六一儀器廠；Tanon 2500 凝膠成像系統：上海天能科技有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

采取梯度稀釋的方法。取0.5g酒曲樣品，倒入裝有50mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，振蕩20～30min，制成10-1濃度的稀釋液。然后按10倍稀釋法進行稀釋分離，即用移液槍取0.5mL 10-2濃度稀釋液加入到裝有4.5mL滅菌蒸餾水的小試管中，充分混勻，制得10-3稀釋液，采用同樣方法依次獲得10-3、10-4、10-5、10-6濃度的稀釋液。分別將上述6個濃度的稀釋液，用移液槍移取0.1mL于不同的YPD固體培養基上，用無菌涂布棒在超凈工作臺上將其涂布均勻，作標記，30℃恒溫培養，12d后觀察并記錄，每個濃度設置3個重復。

1.3.2 形態觀察

參照《酵母菌分類學鑒定標準方法》對供試菌株在形態上進行觀察，進行初步鑒定[11]。

1.3.3 生理生化分析

將分離得到的9株菌株分別接種到糖發酵培養基、氮源同化培養基、碳源同化培養基和醇類同化培養基中，觀察菌株的利用情況。

1.3.4 基因組總DNA的提取[12]

參照《基因工程實驗指導》上介紹的酵母菌基因組提取方法，對篩選的酵母菌進行基因組的提取。

1.3.5 26S rDNA擴增及測序

以制備的酵母菌基因組為模板，以26S rRNA的通用引物，進行擴增。

NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）為上游引物。

NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）為下游引物。

PCR擴增產物切膠回收，與pMD-18T載體連接，轉化入感受態大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆，將具有陽性克隆的樣品送至上海生物工程公司測序完成。將測序結果登錄美國國立生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）用BLAST程序進行序列比對。比對之后用MEGA5建立系統進化樹。以便確定分離菌株的種屬。

2 結果與分析

2.1 酵母菌形態觀察

經過分離，從湖南酒曲中共分離出35株酵母菌菌株，通過形態觀察、生理生化分析和分子生物學鑒定，這35株酵母菌中有一些是序列相同的菌株，通過比對最終確定為9株菌株，分別為A、C、I、L、M、N、O、P、R。所分離的酵母菌的個體形態見圖1。

圖1 酵母菌個體形態Fig.1 Colonial individual form of yeast

2.2 酵母菌菌株的生理生化

經過對這9株酵母菌進行糖發酵、碳源同化、醇類同化、氮源同化的實驗，結果見表1。從表1可以看出，這9株酵母菌的對糖、醇、醛及氮源的利用結果有所不同，這說明不同酒曲發酵的甜酒釀的口感和成分也不同，因此發酵后的酒釀的風味各有不同。后續工作將繼續研究不同的酒釀中的非酵母菌菌株的多樣性和酒釀中的蛋白質、多糖、灰分、氨基酸、有機酸等的不同之處，從而為工業發酵提供理論依據。

2.3 分子生物學鑒定

表1 酵母菌的形態和生理生化特征Table 1 Morphological,physiological and biochemical characteristics of yeast

圖2 26S rDNA PCR結果Fig.2 PCR result of 26S rDNA

利用26S rDNA的通用引物通過PCR擴增出600bp左右的條帶，結果見圖2，將PCR產物割膠回收，與pMD-18T載體連接，轉化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆，將具有陽性克隆的樣品送至上海生物工程公司測序，將所測的序列在NCBI上進行Blast比對，結果顯示A與畢赤克魯酵 母LY9AB499014.1 相 似 性 達 到99%，M 和P 菌 株 與LY9AB499014.1菌株的相似性分別為98%和97%，菌株R與畢赤克魯酵母CEC RCS-0-9JX103190.1菌株相似性達99%。菌株O、I、C分別和釀酒酵母D3C JF715188.1、HA1835 AM262820.1、JN7N-19KC715802.1菌株相似度達到97%、98%、99%，而菌株N、L和釀酒酵母YJM789 JQ277730.1菌株相似度達到98%和99%，由此可見，從酒釀中分離的菌株多為釀酒酵母和畢赤酵母，利用MEGA5構建系統進化樹結果見圖3。

3 結論

對來自福建、江蘇、湖南、上海、浙江等地的酒釀做了初步的菌種鑒定，從結果可以看出，在福建酒曲、蘇州蜂蜜和安琪酒曲中的酵母菌主要是釀酒酵母和覆膜酵母[1]，而在湖南酒曲中主要分離得到的酵母菌是釀酒酵母和畢赤酵母，由此可以了解在酒釀中其主要作用的是釀酒酵母，而非釀酒酵母在其中的作用有待進一步的實驗驗證。從實驗中還分離得到一些霉菌，對這些菌株的驗證正在進行中。接下來的工作重點將進行酵母菌發酵的條件優化，優勢菌株的發酵機制以及酵母菌和其他非酵母菌之間發酵相關性的研究。

圖3 酵母菌的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast

[1]姚淑敏，張 艷，秦宗艷，等.甜酒釀中酵母菌多樣性的研究[J].中國釀造，2013，32（7）：61-64.

[2]QUE F,MAO L C,ZHU C G,et al.Antioxidant properties of Chinese yellow wine,its concentrate and volatiles[J].LWT-Food Sci Technol,2006,39(2):111-117.

[3]SEO D H,JUNG J H,KIM H Y,et al.Identification of lactic acid bacteria involved in traditional Korean rice wine fermentation[J].Food Sci Biotech,2007,16(6):994-998.

[4]SUJAYA I N,ANTARA N S,SONE T,et al.Identification and characterization of yeasts in brem,a traditional Balinese rice wine[J].World J Microb Biot,2004,20(2):143-150.

[5]劉婧競，喬發東.國內外甜酒曲研究進展[J].中國釀造，2010，29（9）：21-25.

[6]孫家芳.關于大曲中有效菌種的培養及應用的探索[J].釀酒，2005，32（1）：16-17.

[7]KURTZMAN C P,ROBNETT C J.Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences[J].Anton Leeuw,1998,73(4):331-371.

[8]CADEZ N,RASPOR P,COCK A W A M,et al.Molecular identification and genetic diversity within species of the genera Hanseniaspora and Kloeckera[J].FEMS Yeast Res,2002,1(4):279-289.

[9]GUTELL R R,FOX G E.A compilation of large subunit RNA sequence presented in a structural format[J].Nucleic Acid Res,1988,16(supp):175-269.

[10]楊 革.微生物學實驗教程[M].北京：科學出版社，2009.

[11]YARROW D,KURTZMAN C,FELL J W.The yeasts,a taxonomic study[M].America:Elsevier science,1998.

[12]朱旭芬.基因工程實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2006.

[13]JEYARAM K,SINGH W M,CAPECE A,et al.Molecular identification of yeast species associated with‘Hamei’-a traditional starter used for rice wine production in Manipur,India[J].Int J Food Microbiol,2008,124(2):115-125.

[14]蘭景軒.醪糟的保健食療[J].家庭醫學，2005，20（1）：49-50.

[15]樋口智子，大場孝宏.酒母からのLeuconostocmesenteroidesspp.mesenteroidesの分離[J].福岡県工業技術センター，2009，19：51-53.