酸棗仁湯對REM睡眠剝奪老年大鼠腦神經細胞凋亡及c-fos基因表達水平的影響

游秋云 王平 張舜波 黃攀攀 章程鵬

·基礎研究·

酸棗仁湯對REM睡眠剝奪老年大鼠腦神經細胞凋亡及c-fos基因表達水平的影響

游秋云 王平 張舜波 黃攀攀 章程鵬

目的觀察酸棗仁湯對快動眼 （REM）睡眠剝奪導致的老年大鼠腦皮層和海馬部位神經細胞凋亡及cfos基因表達Fos蛋白水平變化的影響。方法將自然衰老24月齡W istar大鼠隨機分成空白對照組（等容生理鹽水），老年REM睡眠剝奪組（等容生理鹽水），陽性對照組（舒樂安定0.18 mg／（kg·d）），酸棗仁湯低、高劑量組（12.96，25.92 g／（kg·d））。各組灌胃給藥2周后，除空白對照組外其余各組用自制改良多平臺法剝奪大鼠睡眠48 h制作老年大鼠REM睡眠剝奪模型。通過原位末端標記法 （TUNEL）測定各組大鼠大腦皮層和海馬部位神經細胞凋亡水平，用免疫組化法檢測c-fos基因表達Fos蛋白的水平變化，探討酸棗仁湯對老年失眠引起的腦神經損害及c-fos基因表達變化的影響。結果與空白對照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠腦皮層和海馬部位神經凋亡細胞增多，Fos蛋白表達明顯增高。與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯組腦神經凋亡細胞及Fos蛋白表達明顯下降，但仍高于正常對照組。結論c-fos基因很可能參與了老年大鼠REM睡眠剝奪后的細胞凋亡過程，酸棗仁湯可能是通過抑制腦組織c-fos基因表達上調，抑制神經細胞凋亡而發揮腦保護作用。

老年失眠；酸棗仁湯；大鼠模型；機制

酸棗仁湯出自 《金匱要略》，由酸棗仁、茯苓、知母、川芎、甘草等五味藥組成，諸藥相伍共奏養血安神、清熱除煩之功。臨床主治由肝血不足，陰虛內熱引起的虛煩不眠證。研究表明，該方具有鎮靜催眠、抗焦慮、抗應激、改善睡眠時相結構等作用［1-2］。課題前期研究通過促眠實驗以及Morris水迷宮檢測學習記憶實驗，證實了酸棗仁湯的鎮靜催眠及改善學習記憶能力作用［3］，并與腦內氨基酸類神經遞質的調節密切相關［4］。為了進一步探索酸棗仁湯改善睡眠質量及腦保護作用靶點，本課題擬對老年REM睡眠剝奪引起的大鼠腦神經細胞凋亡及關鍵基因進行檢測，為酸棗仁湯治療老年失眠提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 自然老年健康24月齡W istar大鼠，雌雄各半，50只，體重（500±60）g，由湖北省實驗動物研究中心提前訂購提供，許可證號SCXK（鄂）2008-0005。

1.2 藥物與試劑 酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g組成。全部藥材購自湖北中醫藥大學附屬醫院藥房，常規方法 （以上方藥加5倍于藥材的溫水，浸泡30 min后微火煎煮15 min，文火煎20m in，濾出藥渣，分別將藥液濃縮成每毫升含生藥0.648 g、1.296 g的藥液。）煎煮后經水提制成濃度為64.8%、129.6%，分裝滅菌后4℃保存備用。分別按12.96、25.92 g／（kg·d）劑量（按體表面積系數換算，分別為人體臨床等效劑量的2倍和4倍）給藥。舒樂安定片 （山西亨瑞達制藥有限公司生產，批號111203）。

1.3 儀器與設備 睡眠剝奪箱 （自制），長72 cm×寬48 cm×高30 cm的鼠箱，內置6個直徑為8 cm、高8 cm的平臺，平臺間隔16 cm，平臺與鼠箱箱體壁間隔8 cm，在平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1.0 cm，大鼠在平臺上可自行飲食飲水，并可在不同平臺上自由活動，于箱體上放平行的不銹鋼絲籠罩，上面放水和食物；環境對照箱 （自制），與睡眠剝奪箱相似，但在距其底部8.0 cm處不放置平臺，而是放置一面細密鐵絲網，大鼠在網上可自由活動，其他條件均與睡眠剝奪組相同，以形成與睡眠剝奪組相似的環境。

1.4 動物分組及給藥 將自然老年24月齡W istar大鼠50只（雌雄各半），隨機分成5組，每組10只：空白對照組；老年REM睡眠剝奪組；舒樂安定組 （陽性對照組）；酸棗仁湯低、高劑量組。酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g組成。舒樂安定組大鼠按0.18 mg／（kg·d）給藥，酸棗仁湯低、高劑量組分別按12.96、25.92 g／（kg·d）給藥，給藥容量均為2 m l／100 g。每日1次，連續2w。空白對照組、老年REM睡眠剝奪組均灌服等容積生理鹽水。

1.5 REM睡眠剝奪大鼠模型的制備 對模型組大鼠采用改良多平臺水環境法［5］，放置于自制的睡眠剝奪箱進行REM睡眠剝奪48 h。空白對照組則放置于環境對照箱中。

1.6 大鼠大腦神經細胞凋亡檢測 將大鼠處死后分別取腦皮質及海馬區組織，4%多聚甲醛的固定，常規石蠟包埋，連續冠狀切片［6］。通過原位末端標記法（TUNEL，TdT-mediated dUTP -biotin nick end labeling）測定大鼠大腦皮層和海馬部位神經細胞凋亡水平，具體方法按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒進行免疫熒光染色，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，高倍視野下（40×10）計數200個神經元細胞中陽性細胞數。

1.7 c-fos基因表達Fos蛋白水平檢測 采用免疫組化法檢測c-fos基因表達Fos蛋白的水平變化［7］。分別進行Fos蛋白免疫組化染色，每張切片隨機取三個視野，光鏡下觀察細胞漿中陽性細胞數。

2 結果

2.1 各組對老年REM睡眠剝奪導致的大鼠大腦神經細胞凋亡的影響 與空白對照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠大腦皮質、海馬部位神經細胞凋亡數明顯增高（P＜0.01）；與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯低、高劑量組大鼠大腦皮質、海馬部位神經細胞凋亡數明顯減低（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組對老年REM睡眠剝奪大鼠大腦c-fos基因表達Fos蛋白表達水平的影響 與空白對照組比較，老年REM睡眠剝奪組大鼠大腦皮質、海馬部位c-fos基因表達Fos蛋白水平明顯增高（P＜0.01）；與老年REM睡眠剝奪組比較，酸棗仁湯低、高劑量組大鼠大腦皮質、海馬部位cfos基因表達Fos蛋白水平明顯降低（P＜0.05、P＜0.01）。見表2。

表1 酸棗仁湯對老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質、海馬神經細胞數的影響（±s）

表1 酸棗仁湯對老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質、海馬神經細胞數的影響（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與老年REM睡眠剝奪組比較，bP＜0.01

組別　　只數　　劑量／（g·kg）　　海馬 　　皮質空白對照組　10　　等容31±8　33±10空白對照組　10　　等容　31±8　33±10空白對照組　10　　等容　31±8　33±10舒樂安定組　10　0.18×10-3　92±21b　101±32b酸棗仁湯低劑量組　10　12.96　45±12b　56±21b酸棗仁湯高劑量組　10　25.92　41±9b　52±16b

表2 酸棗仁湯對老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質、海馬部位Fos蛋白表達水平的影響（±s）

表2 酸棗仁湯對老年REM睡眠剝奪大鼠大腦皮質、海馬部位Fos蛋白表達水平的影響（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與老年REM睡眠剝奪組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別　　只數　　劑量／（g·kg）　海馬　　皮質空白對照組　10　　等容23±6　27±7老年REM睡眠剝奪組　10　　等容　69±13a　71±11a舒樂安定組　10　0.18×10-3　58±8b　53±16c酸棗仁湯低劑量組　10　12.96　42±11c　39±11c酸棗仁湯高劑量組　10　25.92　39±9c　37±10c

3 討論

前期實驗采用D-半乳糖復制亞急性衰老大鼠模型［3，8］，雖然自由基水平接近自然衰老大鼠，但是由于該衰老模型是由化學損傷造成的，難以真實反映衰老的生理生化改變，因此本課題改進造模方法而選用自然老年24月齡W istar大鼠，采用國際上公認的多平臺水環境法剝奪睡眠48 h，建立老年REM睡眠剝奪大鼠模型。

有研究表明，失眠對中樞神經系統的毒性作用包括思維紊亂、反應遲鈍、注意力分散、定向障礙以及學習記憶受損等，睡眠剝奪24 h可使人的認知能力下降30%～40%，持續48 h，認知能力下降則高達60%～70%［9-10］。原癌基因c-fos屬于立即早期基因，屬核內蛋白類細胞癌基因，其特點是細胞外各種刺激均能誘導相應的腦功能區神經元及神經膠質細胞的c-fos原癌基因快速、短暫地表達［11］。它不但參與細胞分裂、生長分化、信息識別與傳遞、學習和記憶等生理活動，而且與動物行為及多種疾病的發生發展密切相關，并且同動物的清醒水平也有一定的關系［12］。原癌基因c-fos表達的核磷蛋白（Fos）被認為是在外界刺激與轉錄偶聯的信息傳導過程中起著核內第三信使的作用［13］。

有報道睡眠剝奪可引起c-fos表達增加［14］，靈芝多糖可改善SD大鼠的空間記憶情況，這與降低海馬區c-fos表達有關［15］。因此本課題對cfos基因表達Fos蛋白指標進行了檢測，實驗結果提示，酸棗仁湯可能通過降低大腦c-fos基因表達水平、減少大腦神經細胞凋亡而對老年失眠大鼠起到腦保護作用。結合課題前期酸棗仁湯的促眠實驗以及檢測學習記憶能力的Morris水迷宮實驗結果，多角度表明酸棗仁湯可改善睡眠質量、具有腦保護作用。

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Effect of Suanzao-Rentang on Neuronal Apoptosis and c-fos Gene Expression of Aged Rats with Rapid Eye Movement Sleep Deprivation

You Qiuyun，Wang Ping*，Zhang Shunbo，Huang Panpan，Zhang Chengpeng.*Pharmaceutical Institute，Hubei College of Traditional Chinese Medicine

ObjectiveTo observe the effect of Suanzao-Rentang on neuronal apoptosis and c-fos gene expression in Fos protein levels in cortex and hippocampus of aged ratswith rapid eyemovement（REM）sleep deprivation.MethodsNatural aging 24 months old W istar ratswere random ly divided into control group（isovolumetric saline），REM sleep deprivation elderly group（isovolumetric saline），positive control group estazolam 0.18mg／（kg·d），Suanzao-Rentang low and high dose group 12.96，25.92 g／（kg·d）.Each group was given intragastric administration for two weeks，then each group except the control group ismade REM sleep deprivation for 48h to producemodel of old rats with homemade improved multi-platform.The nerve cells apoptosis of cortex and hippocampus in the rats from each group are determ ined by situ end labeling（TUNEL）and level changes in c-fos gene expression to Fos protein are detected by using immunohistochem istry and explore the effect of suanzao-Rentang on the nerve damage and c-fos gene expression change in elder，which caused by insomnia.Resu lts Compared with the control group，the cerebral cortex and hippocampus nerve cells apoptosis of rats，which are from REM sleep deprivation group，increased，and their Fos protein expression was significantly.Compared with REM sleep deprivation older group，Suanzao-Rentang group’s nerve cells apoptosis and Fos protein expression in brain significantly decreased，but still higher than the normal control group.ConclusionC-fos gene is likely involved in the process of apoptosis in old REM sleep deprivation rats and Suanzao-Rentang inhibit neuronal apoptosis and play a protective role in the brain possibly by inhibiting brain upregulation of c-fos gene.

Elderly insomnia；Suanzao-Rentang；Model rats；Mechanism

國家自然科學基金（NO.81072849）

湖北中醫藥大學藥學院 （游秋云、張舜波、黃攀攀、章程鵬）；430065湖北中醫藥大學國家中醫藥管理局老年性癡呆醒腦益智重點研究室 （游秋云、王平）

王平，E-mail：pwang54＠aliyun.com