DNA疫苗及其在卵黃抗體制備中的應用

李再新，李丙超，胡衛東，唐文才，文 倩，張 智

(四川理工學院a.化學與制藥工程學院;b.生物工程學院，四川 自貢 643000)

DNA疫苗和卵黃抗體作為近年來免疫學新興的產物受到了廣泛關注，兩者的優越性隨著研究的深入也愈加突顯。用DNA疫苗制備卵黃抗體是將兩者優越性聯合，這種卵黃抗體受到了越來越多的研究人員的青睞，通過這種方法獲得的卵黃抗體比常規免疫方法獲得的卵黃抗體在疾病的預防和治療將上更具有優勢。

1 DNA疫苗

DNA疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接導入動物體細胞內，利用宿主細胞的表達系統合成外源蛋白，進而誘導宿主免疫系統產生針對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。與常規疫苗相比，其優點主要為:DNA疫苗易于設計、構建、改造且成本低，適于規模化生產。DNA疫苗其物理化學性質穩定，便于保存和運輸。DNA疫苗通過宿主細胞表達目的抗原蛋白，較之在原核表達系統中表達的蛋白更接近于其抗原蛋白天然結構［1-2］，誘導機體產生更強的免疫應答。DNA疫苗在宿主體內表達持久，因此單一劑量的DNA疫苗可激發長時間的免疫，產生特異的交叉保護。此外，通過DNA重組技術可對DNA疫苗制備時載體所攜帶的基因進行針對性改造和變換，增強了DNA疫苗靶向性和特異性［3-5］。DNA疫苗缺點是僅適用于蛋白質抗原(不適用于非蛋白質抗原，如細菌多糖);有對注射部位細胞生長產生影響的風險;誘導產生的抗體有可能對機體自身的DNA構成威脅;有可能增加機體對抗原的耐受性。

當帶有高效表達調控序列的保護性抗原基因導入動物體細胞后，被細胞攝取而進入細胞核，在載體上的啟動子調控下，轉錄出抗原基因mRNA，后者進入胞漿而轉譯出相應的抗原蛋白。表達的抗原蛋白可以通過2種方式呈遞給宿主免疫系統(圖1):(1)抗原在細胞內經加工后與MHC I分子結合呈遞到細胞表面，最終激活細胞毒CD8+T淋巴細胞(CTL);(2)從細胞中釋放出來與B細胞受體結合，釋放出的蛋白質被抗原呈遞細胞所吸收、降解，然后與MHC II分子結合后最終可激活體液免疫應答。

圖1 DNA疫苗免疫機理示意圖

另外，DNA疫苗免疫部位、宿主表達抗原蛋白的量和免疫調節劑類型等因素，均對DNA疫苗的免疫效果產生相應的影響，其中以免疫途徑和免疫佐劑的影響最為顯著。Fynan研究發現多種途徑合并注射免疫效果最好，其它依次為肌肉、靜脈、鼻腔、皮內和皮下接種［6］，目前最為有效的免疫途徑是使用基因槍將DNA包被的金屬顆粒注入表皮細胞。如果用注射器直接注射要求DNA為10～200 ug(雞、鴨等)，基因槍注射要求的DNA量可少至納克級。在佐劑方面，目前使用的佐劑有多種，其中包括無機佐劑(如氫氧化鋁)、有機佐劑(如脂多糖、分支桿菌等)、合成佐劑(如雙鏈多聚肌苷酸、胞苷酸根等)以及近年來發現的細胞因子等［7-11］。

2 卵黃抗體

卵黃抗體的性質與哺乳動物的IgG相似。由圖2可知兩者均由兩條輕鏈(2L)和兩條重鏈(2H)組成，其中C部為恒定區，V部為可變區。與哺乳動物的IgG比較，卵黃抗體無絞鏈，而C區較大，因此不能與哺乳動物的補體及類風濕因子結合，所以更安全。正常雞卵黃抗體的分子量約為180 KDa，其等電點約為5.2。卵黃抗體與一般哺乳動物IgG相比，卵黃抗體具有較強的耐熱、耐酸、抗離子強度和一定的抗酶降解能力。

在低于75℃條件下，卵黃抗體具有良好的熱穩定性。卵黃抗體粉末制劑在4℃貯存5年或在室溫貯存6個月其活性仍無明顯變化或下降，65℃時可保持24 h以上，70℃時加熱90 min后其活性才明顯下降。60℃，30 min條件下巴氏消毒不影響卵黃抗體;高于80℃，大部分卵黃抗體失去活性［12］。卵黃抗體在 pH4.0～11.0時比較穩定，pH3.0～3.5時活性迅速下降，pH12時活性亦有所下降［13］，而本實驗室制備的輪狀病毒卵黃抗體在pH3.0時仍保持較高的活性。卵黃抗體對胃蛋白酶有較高的抵抗力，但對胰蛋白酶敏感。將胃蛋白酶和卵黃抗體在pH2.0溫育1 h后，所有活性喪失，但在 pH4.0時1 h后可保持91%的活性，甚至溫育10 h后仍有63%活性。卵黃抗體分別與胰蛋白酶和胰凝乳酶溫育8 h，活性分別保持39%和41%［12］。

圖2 IgG和IgY結構示意圖

眾所周知，當抗原來源與免疫系統的親緣性越遠產生的免疫反應就越強烈，因此針對哺乳動物性抗原雞產生的抗體比來自哺乳動物的抗體滴度更好而且成本更低［14-16］。此外，當用哺乳動物蛋白做為抗原時，雞產生的抗體比相應的哺乳動物產生的抗體能夠識別更多的抗原表位［16-19］。雞的卵黃抗體和哺乳動物的免疫球蛋白不會發生免疫學的組織交叉反應［17］。進化的遠緣性決定了在某些類型疾病的預防和治療中卵黃抗體比IgG更具優勢。用同樣的抗原免疫雞和羊，雞的卵黃抗體在第一次免疫后就表現出很高的免疫親和性(109 L/mol)，而為了達到相似的親和活性羊必須接受4次同等劑量的免疫［20］。

3 DNA疫苗和卵黃抗體的應用現狀

迄今，鮮有DNA疫苗試驗能夠誘發足夠強大的免疫反應來治療和預防疾病。然而，在2006年6月已經證實禽流感DNA疫苗具有積極結果和一種西尼羅河病毒DNA疫苗能夠使馬對西尼羅河病毒產生免疫［21］，并且2007年8月在DNA疫苗治療多發性硬化癥的報道中證實有顯著療效［22］。目前，將多種病原體的基因構建到同一載體上可制成針對多種病原體的DNA疫苗，這種針對多種病原體的新DNA疫苗在小鼠模型上已經有廣泛的研究［21］，而且已經被證實通過肌肉免疫或皮下免疫能夠誘導產生很強的免疫反應［22］。這項技術目前已經應用于多種疾病，包括流行性感冒、乙型肝炎病毒、瘧疾、結核病、SIV(豬流感病毒)、HIV(艾滋病病毒)和多種癌癥［21］。

卵黃抗體具有抗胃屏障作用［13］，因此口服純化的卵黃抗體可用于胃腸細菌和病毒感染的被動免疫治療。現已證實口服從免疫雞中獲得的卵黃抗體可成功治療多種胃腸道病原體感染。例如，人和牛的輪狀病毒、牛冠狀病毒、魯氏耶爾森菌、腸毒素性大腸桿菌、遲鈍愛德華菌、葡萄球菌、假單胞菌和幽門螺旋桿菌脲酶 B等［23-24］。

最近有研究表明，使用能夠表達幽門螺旋桿菌脲酶B的DNA疫苗免疫產蛋鴨，獲得的卵黃抗體，不但具有很高的滴度而且能夠特異性識別幽門螺旋桿菌［19］。本實驗室通過初步研究也發現使用輪狀病毒結構蛋白VP7的DNA疫苗免疫產蛋雞，獲得的卵黃抗體能特異性識別輪狀病毒粒子。

4 DNA疫苗制備卵黃抗體的優勢

目前已經證實使用鴨乙型肝炎病毒(和人乙型肝炎病毒相似)的DNA疫苗免疫產蛋鴨可以從蛋黃中分離純化得到相應的抗體［25］。通過肌肉注射將帶有能編碼目的蛋白序列的質粒注射到機體內，序列在機體細胞內表達成蛋白誘發免疫反應，這樣被免疫的鳥類就能作為提供抗原的“工廠”，而不需要再純化抗原蛋白，因為每個蛋的抗體含量要比從動物血清中平均抗體含量要高很多，因此這種非侵染性的方法可以快速獲得大量特異性強、生物活性高的卵黃抗體［25］。這種免疫方法將開辟一個全新的領域。DNA疫苗制備卵黃抗體的優勢主要表現在以下5方面:

(1)不再需要純化抗原蛋白

DNA疫苗制備卵黃抗體是通過基因在動物宿主細胞內直接表達抗原，并誘導機體產生抗體的方法，這種方法避免了傳統免疫方法中昂貴繁瑣的抗原蛋白純化的準備工作，以及由于純化不完全而造成污染的潛在可能。

(2)抗體的質量優勢

因為鳥類和哺乳動物有較遠的親緣關系所以對于哺乳動物抗原鳥類表現出更強的免疫應答。此外，鳥類的卵黃抗體有更顯著的親和活性［23，26］。另外現已證實通過核酸免疫得到的卵黃抗體比通過蛋白免疫得到的抗體的抗原表位更接近于病毒感染機體產生的抗體［27］。經核酸免疫產生的抗原在合成和翻譯后修飾更接近于它們的天然結果［1-2］，因此產生的抗體結果也更接近于天然抗原感染機體產生的抗體。

(3)產量高及生產的可伸縮性

卵黃抗體的生產方法是從蛋黃中大量收集抗體，雞蛋可以看做一個抗體生產的小型“工廠”，因為從每只蛋中可以純化得到大約60～100 mg的抗體，生產量可以根據需要進行調節。

(4)非侵染性的抗體生產法

卵黃抗體是通過從接受過免疫的產蛋雞的雞蛋中獲得，而且每只蛋中得到的抗體要比從兔子血液中得到抗體的平均量高［24］，每天收集雞蛋提取卵黃抗體可以減輕目前用于抗體生產動物(老鼠、兔子)的重復性出血的痛苦。

(5)卵黃抗體作為免疫診斷試劑的優勢

因為卵黃抗體不會與哺乳動物的免疫球蛋白、補體及類風濕因子發生血清型交叉性反應，因此卵黃抗體作為免疫熒光檢測、免疫組織化學、酶聯免疫檢測(ELISA)、Western blotting和免疫電泳的免疫診斷工具有特殊的價值［28-29］。

5 展望

綜上所述，與常規疫苗比較，DNA疫苗是一種更加安全、快速、有效且成本低的免疫疫苗，卵黃抗體作為一種新型抗體更是具有產量高、效價好、易獲取并且適用性廣的特點。因此，用DNA疫苗制備特異性卵黃抗體是將兩者優點綜合，由于在真核細胞內DNA疫苗表達的抗原蛋白更加接近其天然結構，因此獲得的卵黃抗體不僅具有諸多優點而且能夠更加易于識別和結合病毒粒子從而達到更加理想的治療和預防的效果。這種新型的抗體生產方法將會為免疫學的研究開辟更加廣闊的空間。本實驗室欲使用DNA疫苗制備輪狀病毒的卵黃抗體，意在生產一種低成本、高效價、安全穩定且適用于嬰幼兒治療及預防由輪狀病毒引起的感染性腹瀉的卵黃抗體。

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