HPLC法測定7-ACT相關雜質含量

羅艷平，王建霞

(深圳九新藥業有限公司，廣東 深圳 518049)

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HPLC法測定7-ACT相關雜質含量

羅艷平，王建霞

(深圳九新藥業有限公司，廣東 深圳 518049)

目的：建立頭孢曲松鈉生產中中間體7-ACT相關雜質的HPLC測定方法。方法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(0.15m×4.6mm×1.0μm)，紫外檢測器，檢測波長：270nm，流動相：3.2g四庚基溴化銨置400mL乙腈中，加入44mL pH7.0磷酸鹽緩沖液和4mL pH5.0枸櫞酸鹽緩沖液，加水稀釋至1 000mL，過濾，流速：1.0mL/min,進樣量20μL，自身對照法測定7-ACT的相關雜質含量。結果：7-ACT在0.06～3.6ppm濃度范圍內呈現良好的線性關系(相關系數為0.9999)，精密度RSD(n=6)為1.4%；定量限：7-ACT、7-ACA達到0.048ppm，三嗪環達到0.012ppm。結論：本方法專屬性強，操作簡便，結果可靠，可用于7-ACT中相關雜質的測定。

高效液相色譜法；7-ACT；反相色譜柱；相關雜質

頭孢曲松鈉為半合成的第三代頭孢菌素，對大多數革蘭陽性菌和陰性菌都有強大抗菌活性，抗菌譜包括綠膿桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、流感嗜血桿菌、產氣腸細菌、變形桿菌屬、雙球菌屬及金葡菌等。7-ACT是生產頭孢曲松鈉的中間體，因此在生產過程中的起始物料(7-ACA、三嗪環)的殘留及未知雜質的控制，對終端產品雜質控制起關鍵性的作用。本文建立了高效液相色譜法測定7-ACT的相關物質，方法簡單，重現性好。

1 儀器與試藥

HPLC：安捷倫(含在線脫氣機、自動進樣器、四元泵、柱溫箱、多波長紫外檢測器)；7-ACT：(深圳九新藥業有限公司，批號：110401，110402，110403)；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、枸櫞酸鈉、枸櫞酸、乙腈、四庚基溴化胺為分析純或色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；規格：l=0.15m，Φ=4.6mm；流動相：取3.2g四庚基溴化銨置400mL乙腈中，加入44mL pH7.0磷酸鹽緩沖液和4mL pH5.0枸櫞酸鹽緩沖液，加水稀釋至1 000mL,過濾。流速：1.0mL/min,檢測器：紫外檢測器，檢測波長：270nm,進樣量： 20μL，運行時間：2.5倍主峰保留時間。按自身對照法計算雜質含量。

2.2 溶液制備

2.2.1 pH7.0磷酸鹽緩沖液 取磷酸氫二鉀1.36g，磷酸二氫鉀0.4g，置100mL水中溶解后，用磷酸溶液(80%)或氫氧化鉀溶液(10mol/L)調節pH至(7.0±0.1)。

2.2.2 pH5.0枸櫞酸鹽溶液 取2.58g枸櫞酸鈉于50mL水中溶解后，用枸櫞酸(5g溶解在25mL水中)調節pH至(5.0±0.1)。

2.2.3 測試溶液 取供試品約30mg，加流動相100mL使溶解，搖勻，即得。

2.2.4 參照溶液(a) 取測試溶液1.0 mL，用流動相稀釋定容至100.0mL。

2.2.5 參照溶液(b) 分別取5.0mg 7-ACA、三嗪環對照品及5.0mg 7-ACT對照品，用流動相溶解稀釋定容至100.0mL。

2.3 專屬性及系統適用性(參照溶液b)

取參照溶液b，進樣，結果顯示：分離度大于1.5，見表1。系統適用性考察見圖1。

表1 專屬性及系統適用性考察

圖1 系統適用性考察

2.4 線性關系考察

儲備溶液：稱取30mg 7-ACT，用流動相溶解并定容至100mL。取10mL此溶液用流動相溶解并定容至100mL。0.02%API溶液： 取儲備溶液1mL用流動相溶解并定容至50mL，取此溶液1.0mL用流動相溶解并定容至10mL。0.03%API溶液： 取儲備溶液1mL用流動相溶解并定容至50mL，取此溶液1.5mL用流動相溶解并定容至10mL。0.24%API溶液：取儲備溶液0.60mL用流動相溶解并定容至25mL。0.36%API溶液：取儲備溶液0.90mL用流動相溶解并定容至25mL。0.60%API溶液：取儲備溶液1.50mL用流動相溶解并定容至25mL。1.20%API溶液：取儲備溶液3.00mL用流動相溶解并定容至25mL。

計算每份溶液進樣3次的主峰面積的RSD，記錄色譜圖，以濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得標準曲線，結果顯示：7-ACT在所選濃度范圍內線性良好，回歸方程：Y=64 185X+1.5817，相關系數：0.999 9，標準曲線的相關系數均大于0.999 9。見表2。

表2 線性關系考察結果

2.5 精密度考察

取參照溶液(a)，連續進樣6次， 計算7-ACT峰面積RSD，結果顯示：本方法的精密度良好。見表3。

表3 精密度測定結果

2.6 檢測限和定量限測定

儲備溶液：制備7-ACA三嗪環及7-ACT溶液，濃度為0.003mg/mL。檢測限：用儲備溶液不斷稀釋測試直至峰高與噪聲比值為3。定量限：用儲備溶液不斷稀釋測試直至峰高與噪聲比值為10。檢測限和定量限測定結果結果見表4、圖2。結果顯示對以上雜質檢測靈敏。

表4 檢測限和定量限測定結果

2.7 中間精密度

2個分析檢驗人員，3天，分別取樣品1批，按"3.3"項下方法配制，分別精密取測試溶液和參照溶液(a)20μL，用自身對照法計算樣品的7-ACA、三嗪環、最大未知雜質的結果，并計算結果的RSD。見表5。

圖2 7-ACA檢測限及定量限

圖3 三嗪環檢測限及定量限

圖4 7-ACT檢測限及定量限

表5 精密度試驗結果

2.8 樣品測定

取樣品3批(批號：110401，110402，110403)1.0g，按“3.3項”下方法配制，分別精密取測試溶液和參照溶液(a)20μL，用自身對照法計算3批樣品的7-ACA、三嗪環、最大未知雜質，測定結果見表6，色譜見圖5。

2.9 溶液穩定性實驗

取樣品1批，按“3.3”項下方法配制，在冷處/常溫環境下，分別于0h、1h、2h、3h、4h時間取樣品，測試溶液。溶液在冷處放置1h內是穩定的，應現配現用。結果見表7。

圖5 對照溶液及樣品溶液色譜

表6 樣品雜質測定結果

表7 穩定性試驗結果

3 討論

本測定方法系統適用性試驗結果證明五種溶劑峰的理論塔板數均大于5 000，相互分離度均遠大于1.5，說明能良好分離，且沒有干擾。

精密度考察結果證明五種溶劑峰面積的RSD均小于5.0%，本測定方法精密度符合要求。

回收率試驗結果證明五種溶劑、三種濃度回收率均在90.0%～110.0%之間，3次平行測定的RSD均小于5.0%，本測定方法準確性符合要求。

本測定方法專屬性強，操作簡便，結果可靠，可用于頭孢替坦二鈉中五種殘留溶劑的同時測定。

[1] 周海鈞.藥品注冊的國際技術要求.質量部分[M]．北京:人民衛生出版社,2007:126-140.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄ⅧP.

(責任編輯：宋勇剛)

HPLC Method Determination of Related Substance in 7-ACT

Luo Yanping, Wan Jianxia

(Shenzhen Gosun Pharmaceutical Co.,LTD.,Shenzhen 518049,China)

Objective:To establish a method for determination of related substance of 7-ACT by High Performance Liquid Chromatography. Methods:The column was octadecylsilane chemically bonded silica. Mobile phase - Dissolve 2.0 g of tetradecylammonium bromide in 400 mL of acetonitrile, add 44 mL of pH 7.0 phosphate buffer and 4.0mL of pH 5.0 citric acid buffer, and dilute to 1000 mL with water, membrane filtered.Detector: VWD Wavelength of detection：270nm ,Flow rate：1.0mL/min; Injection Volume : 20 ul,A self-calibrated method for determination of related substance of 7-ACT.Results:Under the above condition, there is a good linear relationship in the concentration range measured.Conclusion:The method is simple, accurate and reproducible. Can be used for determination for determination of related substance of 7-ACT.

High Performance Liquid Chromatography; 7-ACT, Reversed-phase Chromatography Column; Related Substance

2014-11-28

羅艷平(1964-)，女，深圳九新藥業有限公司工程師，研究方向為藥品檢驗。

R927.2

A

1673-2197(2014)09-0014-04