黃芩中漢黃芩素的提取制備

李文娟，潘 馨，陳曉蘭，陳維中，廖聯(lián)明*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州350122；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100)

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黃芩中漢黃芩素的提取制備

李文娟1，潘 馨1，陳曉蘭2，陳維中2，廖聯(lián)明1*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州350122；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100)

為建立制備大量高純度漢黃芩素的方法，將中藥黃芩50g用pH 5水水解12h，再用95%的乙醇提取，得到的提取物浸膏，過(guò)30～60目的聚酰胺樹(shù)脂柱純化，將含有漢黃芩素的洗脫物采用高速逆流色譜(HSCCC)進(jìn)行分離。通過(guò)該方法制得漢黃芩素525mg，純度為98.7%。

漢黃芩素；黃芩；提取；聚酰胺柱；純化；高速逆流色譜

黃芩為唇形科(Labiatae)植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，是常用中藥。主要生物活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素，其中漢黃芩素生物活性廣泛，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抑制腫瘤作用[1]，尤其是其抗腫瘤活性引起廣泛研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)黃芩自身酶催化水解使?jié)h黃芩苷轉(zhuǎn)化為漢黃芩素，以提高原藥材中漢黃芩素的含量。用高速逆流色譜(HSCCC)制備漢黃芩素。高速逆流色譜是一種獨(dú)特的液-液分配色譜分離技術(shù)，兩相液體互不相溶，一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相，待分離物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)分離。目前用高速逆流制備漢黃芩素的研究較少，本實(shí)驗(yàn)用溶劑體系對(duì)黃芩中漢黃芩素的純化制備，探索最佳純化制備條件。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

電熱套(天津泰斯特儀器有限公司)；玻璃層析柱(40mm×600mm)；1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司HSCCC-TBE300A)。

1.2 試劑與材料

乙醇、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、磷酸(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；雙蒸水、超純水，自制。聚酰胺樹(shù)脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；漢黃芩素(批號(hào)：MUST-12092303，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所)；黃芩藥材(購(gòu)自安徽同泰藥業(yè)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃芩的提取純化

取黃芩粉末50g，精密稱定，置1 000mL容量瓶中，加入pH為5的超純水，浸泡12h，加入10倍體積95%乙醇，提取2次，每次2h。合并提取液，過(guò)濾，濃縮回收乙醇，得到浸膏。浸膏加水，使其呈混懸狀態(tài)，進(jìn)行聚酰胺層析柱上樣，上樣量2g/100mL，依次用水、30%、60%、95%乙醇洗脫。將含有漢黃芩素的洗脫液合并，濃縮干燥，得到黃色粉末。

2.2 溶劑體系和樣品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比7∶3∶5∶5)兩相溶劑體系，充分振搖后在室溫下靜置。分離上下相，使用前分別超聲脫氣30min，待用。取純化粉末40mg，用等體積的上下相溶劑體系溶解，溶解液作為樣品溶液，備用。

2.3 高速逆流色譜法的分離制備

用最大流速(9.99mL/min)向HSCCC分離管中泵入上相，待上相充滿整個(gè)管路后，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為850r/min，以2.0mL/min流速泵入下相，待流動(dòng)相從柱出口流出，兩相在分離管中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，注入樣品溶液20mL，在275nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖接收目標(biāo)成分。

2.4 高效液相色譜分析條件

色譜柱：Hypersil ODS C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，大連依利特)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水(54∶46)，流速為1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)275nm，進(jìn)樣量10μL。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取漢黃芩素(純度99.5%)對(duì)照品1.83mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，搖勻，至刻度定容，作為對(duì)照品貯備液。分別進(jìn)樣5、10、15、20、25μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=5 397.1X-751.38，R2=0.999 9，線性范圍為0.915～4.575μg。

3 結(jié)果

3.1 黃芩提取純化

本實(shí)驗(yàn)按上述提取方法得浸膏21.6g，得膏率為43.2%，浸膏經(jīng)HPLC測(cè)得漢黃芩素含量為3.267%。提取浸膏過(guò)30～60目聚酰胺層析柱，漢黃芩素存在于60%乙醇洗脫液中，洗脫液濃縮干燥后得到5.1g黃色粉末，經(jīng)HPLC測(cè)得漢黃芩素含量為13.57%。

圖1 黃芩粗提物的HPLC色譜

圖2 過(guò)聚酰胺層析柱純化的黃芩提取物的HPLC色譜

3.2 高速逆流色譜法的制備

一般用于HSCCC的溶劑系統(tǒng)，應(yīng)滿足下列幾個(gè)方面的要求[2]：①不造成樣品的分解或變性；②足夠高的樣品溶度；③樣品在系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)值；④固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留；⑤溶劑易揮發(fā)以方便后續(xù)處理。其中固定相的保留率要達(dá)到50%以上，分配系數(shù)K值在0.5～2之間可以得到很好的分離效果。

漢黃芩素是一種黃酮類化合物，極易溶于甲醇、乙醇、丙酮，溶于醋酸乙酯和氯仿，微溶于苯和水，不溶于石油醚[1]。根據(jù)其性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選擇疏水性體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水。根據(jù)文獻(xiàn)[3]，將樣品溶于等體積的上下相中，分別取等體積的上下相進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)公式：K=cs /cm(cs ：溶質(zhì)在固定相中的濃度；cm ：溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度)[2]從而計(jì)算漢黃芩素的分配系數(shù)，選擇漢黃芩素分離系數(shù)在0.5～2之間的體系，進(jìn)行高速逆流實(shí)驗(yàn)，根據(jù)分離效果，最后選定正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水比列為7∶3∶5∶5分配體系，保留率R為77.73%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溶劑體系中漢黃芩素的分配系數(shù)

通過(guò)以上條件進(jìn)行HSCCC分離純化，結(jié)果見(jiàn)圖3，譜圖顯示漢黃芩素在2h左右出峰，持續(xù)時(shí)間30min，可以看出漢黃芩素峰與其前后峰均分開(kāi)。從5.1g過(guò)聚酰胺層析柱純化的黃芩提取物進(jìn)一步純化得到525mg漢黃芩素，經(jīng)HPLC分析其純度為98.7%。HPLC色譜及其紫外光譜見(jiàn)圖4。

圖3 過(guò)聚酰胺層析柱純化的黃芩提取物的HSCCC色譜

圖4 HSCCC漢黃芩素流分的HPLC色譜

4 討論

黃芩中漢黃芩素含量較低，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道不同產(chǎn)地含量不同，大約范圍為0.01%～0.35%[4]。參考現(xiàn)有的提取方法和漢黃芩素的極性大小，本實(shí)驗(yàn)采用自身酶水解法使?jié)h黃芩苷轉(zhuǎn)化為漢黃芩素，加入4倍體積pH為5的水酶解12h[5-8]。4倍體積水不僅滿足了水解的需要，而且水解完成后基本上沒(méi)有剩余水分；12h可以保證水解完全。漢黃芩素屬黃酮類化合物，因其本身所帶有的酚羥基較多而在溶液中不穩(wěn)定，根據(jù)文獻(xiàn)記載本實(shí)驗(yàn)選擇pH為5的水進(jìn)行水解；根據(jù)文獻(xiàn)記載95%乙醇[9-10]能使?jié)h黃芩素較充分地溶出，故本實(shí)驗(yàn)采用95%乙醇進(jìn)行提取。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)的提取得膏率及其中漢黃芩素含量均較高。

黃芩粗提物的HPLC色譜(見(jiàn)圖1)主要有2個(gè)物質(zhì)的峰，其中在25min左右的峰為漢黃芩素，幾乎沒(méi)有看到漢黃芩苷出峰，說(shuō)明漢黃芩苷水解為漢黃芩素，增加了漢黃芩素的含量。圖2說(shuō)明過(guò)完60目聚酰胺層析柱的提取物中棄除了一些雜質(zhì)，提高了漢黃芩素純度，為后面的HSCCC分離減輕了難度。

本實(shí)驗(yàn)HSCCC體系方法不僅可以把漢黃芩素完全分離出來(lái)，也可以將前面出現(xiàn)的大峰物質(zhì)及其后面的小峰物質(zhì)分離出來(lái)，表明本系統(tǒng)分離度良好。配備的固定相和流動(dòng)相，跑完一次樣品差不多都可以用完，不會(huì)造成其中一相過(guò)度剩余而浪費(fèi)試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Extraction and Preparation of Wogonin from Radix Scutellariae

Li Wenjuan1,Pan Xin1,Chen Xiaolan2,Chen Weizhong2,Liao Lianming1﹡

(1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122,China; 2.Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, the First Affiliated Hospital, Fujian 350122,China)

To develop a method for large scale preparation of high-purity Wogonin from Radix Scutellariae. 50g of Radix Scutellariae was hydrolyzed in water (pH 5) for 12h,and then extracted with 95% ethanol.The extractum was seperated with 30～60 mesh polyamide resin column. Fraction with Wogonin was subjected to high-speed countercurrent chromatography (HSCCC ) . 525mg Wogonin is obtained with a purity 98.7%. Thus an effective method for preparing high-purity Wogonin was established.

Wogonin; Radix Scutellariae; Extraction; Polyamide Resin Column; Purifion；HSCCC

2014-01-03

李文娟(1985-)，女，福建中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幙鼓[瘤活性成分。

作者簡(jiǎn)介：廖聯(lián)明(1968-)，男，福建中醫(yī)藥大學(xué)副教授，研究方向?yàn)橹兴幙鼓[瘤機(jī)制。E-mail：llm@fjtcm.edu.cn。

R284.2

A

1673-2197(2014)09-0033-02