乙肝相關(guān)性肝癌患者中Foxp3啟動子區(qū)甲基化及其表達(dá)的研究＊

陜西省人民醫(yī)院 （西安710068） 黨 珊 陳 譜 張冰斐 張 健 周 健 史麗萍

近年來研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在免疫微環(huán)境的紊亂，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）由于具有免疫抑制功能，在腫瘤免疫方面具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3被認(rèn)為是Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持的主要調(diào)節(jié)基因，能增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，下調(diào)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。進(jìn)一步研究證實(shí)，在T細(xì)胞活化過程中，位于Foxp3基因第一外顯子的一個(gè)CpG島控制著Foxp3的表達(dá)。CpG島的甲基化狀態(tài)與外周血中Treg細(xì) 胞 表 達(dá) Foxp3 有 關(guān)［1－2］。 乙 型 肝 炎 病 毒（HBV）感染是原發(fā)性肝癌（HCC）的首要病因，約占病因的50%［3］。大量研究表明HBV及其編碼蛋白對宿主基因，尤其是腫瘤相關(guān)調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因的影響，在HBV致癌過程中發(fā)揮重要作用，但機(jī)制仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)從腫瘤免疫及表觀遺傳學(xué)角度入手，研究轉(zhuǎn)錄因子Foxp3啟動子區(qū)的甲基化在乙肝相關(guān)性肝癌患者中的水平，探討Foxp3在乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)病中的意義，為乙肝相關(guān)性肝癌的治療提供新的思路。

對象與方法

1 研究對象 選自2010年1月到2012年1月于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科住院的HCC手術(shù)患者的癌組織34例。肝癌組織標(biāo)本參照美國肝病學(xué)會（2000）消化系統(tǒng)腫瘤分類進(jìn)行臨床和病理學(xué)診斷，入選患者診斷及臨床病理資料均明確。伴有人類自身免疫缺陷病毒感染以及酒精性、自身免疫性肝病，丙肝患者均被除外，且每位患者在留取組織標(biāo)本前均未接受放化療及免疫治療。本研究獲得西京醫(yī)院倫理委員會通過，并經(jīng)患者知情同意。

2 主要儀器及試劑 酚氯仿異戊醇購自Wolsen公司，Bisulfite清洗柱購自Promega公司，焦磷酸試劑盒購自Qiagen公司，瓊脂糖微珠購自GE Healthcare公司，RNA提取試劑盒TRIzol Reagant為Invitrogen公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Gibco公司，熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司，引物由上海Invitrogen公司合成。RT－PCR儀購自BIO－RAD公司，焦磷酸測序儀購自Qiagen公司。

3 肝癌細(xì)胞中Foxp3mRNA檢測 采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA后行real time RT－PCR，F(xiàn)oxp3引物正義：5’－ttctgtcagtccacttcacca－3’，反義5’－cacccaaagcctcagacct－3’；內(nèi)參照18S引物正義：5’－cgccgctagaggtgaaattc－3’，反 義 5’－ctttcgctctggtccgtctt－3’。

4 焦磷酸測序 經(jīng)過Bisulfite處理的DNA通過焦磷酸測序的方法檢測Foxp3啟動子區(qū)的甲基化水平。準(zhǔn)備8聯(lián)管及瓊脂糖微珠固定體系，在24孔板中加入25μl 0.3μM的測序引物，在真空泵中捕獲微珠，清洗，釋放微珠捕獲的DNA，80℃孵育3min，室溫冷卻。根據(jù)提示往試劑倉中加入相應(yīng)的堿基、酶和底物，上機(jī)檢測。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較在滿足正態(tài)性和方差齊性要求時(shí)采用t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)性和方差齊性要求時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Foxp3mRNA在HBV陽性及陰性肝癌組織中的表達(dá) Foxp3mRNA在29例HBV陽性肝癌組織中為10.318±13.672，高于在5例HBV陰性肝癌組織中的表達(dá)3.510±2.414，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2 HBV陽性和陰性肝癌組織中Foxp3甲基化水平 見圖1。Foxp3的甲基化水平在HBV陽性肝癌組織與HBV陰性肝癌組織中無明顯差異，A－E5個(gè)位點(diǎn)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。圖2顯示焦磷酸測序的5個(gè)甲基化位點(diǎn)。

圖1 Foxp3 5個(gè)常見甲基化位點(diǎn)的甲基化水平在HBV陽性和陰性肝癌組織中的比較

討 論

研究認(rèn)為，肝癌組織中Treg細(xì)胞數(shù)量較癌旁組織、正常肝組織明顯增多，且與HCC的TNM分期、預(yù)后有關(guān)［4－5］。此外Treg細(xì)胞在維持對自身和外來抗原的免疫耐受中起重要作用，并可能參與HBV感染慢性化的過程，也就是說一方面可以抑制過度免疫病理損傷，另一方面也可能有利于病毒的持續(xù)感染［6］。這群細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的持續(xù)表達(dá)密切相關(guān)，F(xiàn)oxp3被看作是最重要且最具特異性的Treg細(xì)胞的標(biāo)志。

本研究中HBV陽性肝癌組織中Foxp3mRNA的表達(dá)水平高于對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HBV感染可上調(diào)Foxp3mRNA表達(dá)，據(jù)以往報(bào)道及該結(jié)果推測肝組織中Foxp3水平的增高可能是機(jī)體調(diào)節(jié)過度免疫反應(yīng)的一種機(jī)制，HBV感染增加了進(jìn)展為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)［7］。該結(jié)果有助于加深我們對乙型肝炎免疫發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，對闡明HBV逃逸機(jī)體免疫反應(yīng)、引起持續(xù)性感染的機(jī)制具有重要意義。

最新研究表明Foxp3長期、穩(wěn)定存在離不開以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，而關(guān)于乙肝相關(guān)性肝癌中Foxp3甲基化的水平，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HBV陽性與陰性肝癌組織中Foxp3的甲基化水平不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明乙肝相關(guān)性肝癌中引起Foxp3升高的調(diào)控機(jī)制可能與甲基化無關(guān)，或者調(diào)控方式是多方面的，甲基化可能不起主要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者中HBV感染使Foxp3mRNA表達(dá)升高，F(xiàn)oxp3mRNA表達(dá)升高可能不是或不完全是通過甲基化修飾來調(diào)控的。進(jìn)一步可在細(xì)胞水平敲除HBx蛋白觀察Foxp3甲基化水平的變化來證實(shí)二者的關(guān)系，此外，乙肝相關(guān)性肝癌的免疫發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的，尋找有效調(diào)控Foxp3mRNA表達(dá)的手段對乙肝相關(guān)性肝癌的治療有重要意義。

［1］ Janson PC，Winerdal ME，Marits P，et al.FOXP3promoter demethylation reveals the committed Treg population in humans［J］.PLoS ONE，2008，3（2）：1612.

［2］ Huehn J，Polansky JK，Hamann A.Epigenetic control of FOXP3expression：the key to a stable regulatory T－cell lineage［J］.Nat Rev Immunol，2009，9（2）：83－89.

［3］ Hashem B，El－Serag.Epidemiology of Viral Hepatitis and Hepatocellular Carcinoma［J］.Gastroenterology，2012，142（6）：1264－1273.

［4］ Kobayashi N，Hiraoka N，Yamagami W，et al.Foxp3＋regula－tory T cells affect the development and progression of hepatocarcinogenesis［J］.Clin Cancer Res，2007，13（3）：902－911.

［5］ 肖時(shí)湘，韓 濤，王媛媛，等.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在慢性肝病中的變化［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2010，39（7）：831－833.

［6］ Belkaid Y，Rouse BT.Natural regulatory T cells in infectious disease［J］.Nat Immunol，2005，6（4）：353－360.

［7］ Aalaei－Andabili SH，Alavian SM.Regulatory T cells are the most important determinant factor of hepatitis B infection prognosis：a systematic review and meta－analysis［J］.Vaccine，2012，30（38）：5595－5602.