miRNA－106a在肝癌中的表達及其作用

西安交通大學醫學院（西安710061） 陳雙江 王 錚 姚英民 郭 雄

肝癌是發病率較高的腫瘤之一，其惡性程度高、進展快、病死率高，確診時大部分已屬中晚期，從而失去治療的最佳時機，復發和轉移是影響肝癌預后的主要因素。微核糖核酸（miRNA）是一類進化上高度保守、內源性的非編碼單鏈小RNA，可以通過抑制或降解靶基因mRNA從而達到抑制靶基因的作用［1］。有研究顯示大概有60%編碼蛋白的基因受到miRNA的調控［2］。miRNA－106a（miR－106a）作為一種上調的致癌基因在許多腫瘤中被證實［3－4］。我們通過實時定量PCR技術檢測miR－106a在20例肝癌手術標本與其對應的癌旁組織中的表達情況，并通過人工合成miR－106amimics或inhibitors轉染肝癌細胞株HepG－2，觀察其對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響，并探討其內在分子機制。

材料與方法

1 材 料 西安交通大學醫學院第一附屬醫院外科手術切除的肝癌組織及其對應癌旁正常組織20例（男14例，女6例，平均年齡56.7歲），術后均經病理檢查確認。標本收集后置于－80℃冰箱保存，所有患者術前均未經放療、化療。人肝癌細胞HepG－2由西安交通大學醫學院生物醫學研究實驗中心提供并保存。DMEM培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司。TRIzol試劑購自美國ambion公司，逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，所有引物委托北京鼎國昌盛公司設計并合成，實時定量PCR試劑SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自日本TaKaRa公司，脂質體2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，miR－106 mimics／inhibitors及 NC對照購自上海吉瑪公司，MTT購自美國Sigma公司，DMSO購自美國Sigma公司，transwell小室購自美國 Millipore公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司，GAPDH、TGFBR2、E－cadherin、N－cadherin和 Vimentin抗體均購自美國Santa cruze公司。其他試劑均為國產分析純。

2 總RNA提取 稱取保存在－80℃冰箱中的組織10mg，在冰上用一次性研磨皿磨碎，并加入1ml Trizol，按說明書繼續操作提取總RNA，用Nanodrop－2000測量總RNA濃度及A260／280比值，取比值為1.8～2.0之間的RNA進行下一步實驗。細胞RNA提取按每孔加1ml Trizol，其余步驟同組織提取RNA。

3 引物及寡義核苷酸合成 引物序列見附表，miR－106amimics：AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG， miR－106ainhibitors：CUACCUGCACUGUAAGCACUUUU。

附表 引物設計序列及產物大小

4 miR－106a反轉錄 取1μl總RNA，加入特異性莖環引物，按試劑盒說明書操作逆轉錄cDNA，反應溫度：42℃15min，85℃5s。

5 QRT－PCR實驗 使用iQ5Multicolor Real－Time PCR Detection System（CA）檢測 miR－106a在肝癌中的表達情況（以U6做內參），并檢測轉染后肝癌細胞中 TGFBR2、E－cadherin、N－cadherin和 Vimen－tin的表達情況（以GAPDH做內參）。反應條件：變性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，共40個循環，72℃延伸5min終止反應。所有反應均設立3個復孔，用2－△△Ct計算癌組織比癌旁組織的相對表達量。

6 細胞培養及分組 細胞株用含10%小牛血清和雙抗的DMEM培養基在37℃，5%CO2的培養箱中培養。實驗將肝癌細胞分為3組，mimics組（即轉染miR－106amimics組）、NC組（轉染無意義寡核苷酸組）、inhibitors組（即轉染 miR－106ainhibitors組）。細胞接種于6孔板中，待融合度為50%時按Lipo2000說明書分別轉染。每組分別干預培養24、48、72、96h用于MTT實驗，轉染后48h用于檢測侵襲力、提取總RNA及總蛋白。

7 MTT實驗 將干預過的細胞用胰酶消化，計數，分別制成5×105個／ml的單細胞懸液，按每孔100μl接種于96孔板，分別在24、48、72、96h孵育后避光分別加入 MTT 20μl（5mg／ml），37℃孵育箱孵育4h，棄去上清，加入200μl DMSO，搖床震蕩，酶標儀檢測480nm的OD值，取5孔平均值。

8 Transwell侵襲實驗 在冰上融化Matrigel基質膠過夜，稀釋后加100μl于上室，37℃孵育4h使Matrigel膠凝固，將分組干預48h后的細胞用胰酶消化，含1%FBS的DMEM培養基重懸細胞，按1×105個／ml的濃度種入上室200μl細胞，下室加入含20%FBS的DMEM培養基600μl。在37℃、5%CO2的培養箱中孵育24h后，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定，0.1% 結晶紫染色，PBS洗凈后顯微鏡下高倍視野計算細胞數，每小室隨機取5個視野，并記錄每個視野細胞數。以計數穿膜細胞數目來間接反映腫瘤細胞侵襲能力大小。

9 蛋白印跡實驗 用PBS洗細胞，去掉殘留培養基，每孔細胞加入200μl RIPA裂解液，吹打，冰上裂解1h，用細胞刮刀將細胞收集入離心管，12000r／min離心，收集上清液，加loading buffer，100℃5min使蛋白變性，每孔上樣10μl后用 SDS－PAGE 電泳，轉PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃孵育過夜，PBST洗膜后孵育二抗2h，洗膜，化學發光法檢測，暗室內壓片曝光。應用ChemiImage 5500自動電泳凝膠成像分析儀照相。

10 統計學處理 數據采用SPSS13.0軟件分析，測定結果均以±s表示。應用單因素方差分析，組間均數的比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05。

結 果

1 miR－106a在肝癌組織中的表達 PCR用于20對肝癌組織及其癌旁組織miR－106a的表達情況檢測，結果顯示，miR－106a在14／20（70%）的肝癌組織中高表達（上調超過2倍）；與正常癌旁組織相比平均上調3.76倍（見圖1）。

圖1 miR－106a在肝癌組織中的表達上調

2 miR－106a對HepG－2細胞增殖的影響 通過轉染 miR－106amimics上調 HepG－2內的 miR－106a成熟體的水平，并在轉染24h后通過qRT－PCR確認轉染效率，結果顯示終濃度為50nm／L的mimics明顯促進肝癌細胞增殖，并在48h效應基本達到頂峰，而轉染100nm／L的inhibitors可以明顯抑制肝癌細胞的增殖，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 miRNA－106a對肝癌細胞HepG－2增值率的影響

3 miR－106a對HepG－2細胞侵襲的影響 miR－106amimics干預細胞48h后，肝癌細胞株HepG－2的侵襲能力明顯增強，結果顯示穿過基底膜的細胞數量增加，與NC對照組相比，結果差異具有顯著性（P＜0.05）（見圖3）；而對 HepG－2中的 miR－106a進行抑制后，則侵襲能力明顯降低。

圖3 miR－106a對肝癌細胞HepG－2侵襲力的影響

4 miR－106a對 HepG－2 細胞 TGFBR2、E－cadherin、N－cadherin和 Vimentin表達的影響 根據miRNA預測軟件（TargetScan）預測TGFBR2在肝癌中可能為miR－106a的靶基因。因此，我們使用實時定量PCR 技術檢測了 TGFBR2及 E－cadherin、N－cadherin和Vimentin的mRNA的表達水平變化，并且通過western blot技術檢測了這四個基因的蛋白質表達水平變化。結果顯示，mimics干預組的TGFBR2在mRNA及蛋白水平下降，而抑制細胞內源性miR－106a成熟體的水平后，可以觀察到TGFBR2的表達水平升高，因此，提示TGFBR2可能為肝癌細胞中miR－106a的靶基因。在檢測了腫瘤細胞EMT指標E－cadherin、N－cadherin和Vimentin后，可以發現間質指標N－cadherin和Vimentin的mRNA及蛋白水平都在mimics干預后得到提升，而上皮指標E－cadherin的表達受到抑制。在抑制miR－106a水平后，N－cadherin和Vimentin的表達水平均有下降，而E－cadherin的表達則上調（見圖4）。這些結果說明miR－106a可以增強肝癌細胞株HepG－2的EMT過程，從而增強其侵襲力。

圖4 miR－106a對 HepG－2TGFBR2、E－cadherin N－cadherin和Vimentin表達的影響

討 論

近年來，miRNA作為一種內源性調控基因表達的非編碼小RNA分子受到廣泛關注，尤其是在腫瘤研究中更是備受矚目，其通過癌基因或抑癌基因調控下游靶基因，從而參與腫瘤發生發展，在腫瘤增殖、周期、耐藥及侵襲轉移等生物學特性方面都有重要的調控作用［5］。而miRNA與腫瘤的相關性及其對多個靶基因的調控作用為研究腫瘤發生發展的機制提供了新的方法途徑，使腫瘤分子生物學研究有了新的突破口。在本實驗中，我們使用了莖環法來反轉錄cDNA，即使用特異性的反轉錄莖環引物，與普通的加尾法相比，使反轉錄的靈敏度和特異性提高［6］。

在肝癌的發生發展過程中，多基因的相互作用使其機制異常復雜，而miRNA對其任何一個靶基因的調控都可能對腫瘤的發生發展起著重要作用。轉化生長因子βⅡ型受體（TGFBR2）是TGFβ信號的直接受體，被認為是抑癌基因，TGFBR2的表達下調可以使腫瘤細胞逃逸其負調控而增殖，促使了腫瘤的發生發展［7］。我們通過實時定量PCR在肝癌中發現miRNA－106a表達上調，結合miRNA靶基因預測軟件分析，在調控 miRNA－106a后，TGFBR2mRNA、蛋白水平的變化證實其可能為miRNA－106a靶基因，從而可以認為在肝癌細胞HepG－2中，miRNA可能通過TGFBR2來調控肝癌的發生發展，并且，在其他的報道中也觀察到TGFBR2作為一種抑癌基因在多種腫瘤中都表達下調［8－9］。文 獻 報道［10－11］，miRNA－106a也可作用于腫瘤細胞調控其靶基因RB1使腫瘤細胞凋亡減少，增殖加強，這與我們的實驗結果也是一致的。

上皮間質轉化（EMT）是上皮細胞向間充質細胞轉化的現象，使上皮細胞失去極性，細胞骨架重塑獲得移動能力，現有大量研究證實該過程與腫瘤的侵襲轉移密切相關［12］。實時定量PCR與 Western blot實驗結果顯示N－cadherin和Vimentin作為腫瘤間質指標在mimics干預后的HepG－2細胞明顯上調，E－cadherin明顯下調。因此，可以認為miRNA－106a促進了肝癌細胞株HepG－2的EMT過程，增強了腫瘤細胞的侵襲能力，并且transwell實驗也觀察到肝癌細胞的穿膜數量增加，侵襲力增強，可以認為miRNA－106a使肝癌細胞的侵襲力增強。

在本研究中，我們在肝癌組織中檢測到miR－106a的表達水平明顯升高，而在對肝癌細胞內源性miR－106a的水平干預后，結果顯示miR－106a可以促進肝癌細胞增殖、侵襲，而抑制其水平后可以得到相反的結果，實時定量PCR及western blot結果提示抑癌基因TGFBR2可能是miR－106a的靶基因，并且EMT指標E－cadherin、N－cadherin 和 Vimentin 的 水 平 也 受 到miR－106a調控。以上結果說明miR－106a在肝癌細胞中對增殖和侵襲有重要作用，而miR－106a在肝癌中其他的靶基因需要進一步研究，以確認其促進腫瘤發生發展具體機制，為miRNA的臨床治療提供基礎理論依據。

［1］ Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281－297.

［2］ Friedman RC，Farh KK，Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92－105.

［3］ Catela IT，Aralica G，Cacev T，et al.miR－106aoverexpression and pRB downregulation in sporadic colorectal cancer［J］.Exp Mol Pathol，2013，94（1）：148－154.

［4］ 王 歡，翁國星，陳智群，等.早期非小細胞肺癌組織中miR－106a的表達變化及意義［J］.山東醫藥，2010，50（22）：51－52.

［5］ Zhang B，Pan X，Cobb GP，et al.microRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］.Dev Biol，2007，302（1）：1－12.

［6］ 時宿妹，張 越，張傳宇，等.2種微小RNA實時定量PCR檢測方法的比較［J］.生物技術通訊，2010，21（3）：377－384.

［7］ Derynck R，Akhurst RJ，Balmain A.TGF－beta signaling in tumor suppression and cancer progression［J］.Nat Genet，2001，29（2）：117－29.

［8］ Mamiya T，Yamazaki K，Masugi Y，et al.Reduced transforming growth factor－beta receptor II expression in hepatocellular carcinoma correlates with intrahepatic metastasis［J］.Lab Invest，2010，90（9）：1339－1345.

［9］ Tan AR，Alexe G，Reiss M.Transforming growth factorbeta signaling：emerging stem cell target in metastatic breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2009，115（3）：453－95.

［10］ Jiang Y，Wu Y，Greenlee AR，et al.miR－106a－mediated malignant transformation of cells induced by anti－benzo［a］pyrene－trans－7，8－diol－9，10－epoxide［J］.Toxicol Sci，2011，119（1）：50－60.

［11］ Catela IT，Aralica G，Cacev T，et al.miR－106aoverexpression and pRB downregulation in sporadic colorectal cancer［J］.Exp Mol Pathol，2013，94（1）：148－154.

［12］ 張 斌，黃洪章.miRNA調控EMT與口腔癌化療耐藥關系的研究進展［J］.中國口腔頜面外科雜志，2011（5）：435－438.