人工濕地污水處理系統春季空氣微生物群落結構分析

吳等等,宋志文,王 琳,徐愛玲,夏 巖 (青島理工大學環境與市政工程學院,山東 青島 266033)

人工濕地污水處理系統春季空氣微生物群落結構分析

吳等等,宋志文*,王 琳,徐愛玲,夏 巖 (青島理工大學環境與市政工程學院,山東 青島 266033)

通過構建16S/18S rDNA基因文庫,分析自由表面流人工濕地污水處理系統春季空氣細菌和空氣真菌群落結構特征.結果表明,空氣細菌分布在變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍藻門(Cyanophyta)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes),主要為β-變形菌綱(71.04%)、γ-變形菌綱(12.03%)、α-變形菌綱(3.83%)、藍藻綱(4.38%)、芽孢桿菌綱(3.28%)和鞘脂桿菌綱(2.19%),優勢菌屬是馬賽菌屬(Massilia 66.66%)、假單胞菌屬(Pseudomonas 4.37%)、藍絲細菌屬(Cyanothece 3.83%)和沙雷氏菌屬(Serratia 3.28%).空氣真菌主要類群為座囊菌綱(Dothideomycetes 61.18%),其次是接合菌綱(Zygomycetes 16.47%)、盤菌綱(Discomycetes 14.12%),優勢菌屬是核腔菌屬(Pyrenophora 48.31%)、被孢霉屬(Mortierella 15.7%)、緣刺盤菌屬(Cheilymenia 12.4%)、Boothiomyces (4.5%).人工濕地空氣微生物中未檢測出大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella spp.)和產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),但存在粘質沙雷氏菌(S. marcescens)、惡臭假單胞菌(P. putida)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)等致病菌或條件致病菌.

人工濕地；空氣細菌；空氣真菌；群落結構；基因文庫

生活污水中含有沙門氏菌(Salmonella spp.)、志賀氏菌(Shigella spp.)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和腸道病毒等多種病原微生物,其處理過程中由于污水流動、溢流跌落、攪拌或曝氣產生的微生物氣溶膠增加了污水處理廠工作人員及周邊人群的健康風險[1].對污水處理廠工作人員和周邊人群健康狀態研究顯示,呼吸道疾病、腸道疾病、污水源病毒感染等疾病與微生物氣溶膠密切相關.

人工濕地具有凈化污染物效果好、運行費用低、易維護等優點,在污水處理、污染物控制和改善環境等方面應用廣泛[2].與傳統的二級污水處理工藝相比,人工濕地微生物氣溶膠對公眾健康和生態安全的影響更應該引起足夠重視[3],主要表現在:(1)隨著城市化進程加快,原來遠離城區的人工濕地距離商業居住區越來越近,隨之也帶來環境衛生安全問題.(2)與傳統污水處理工藝的嚴格封閉式管理不同,人工濕地是相對開放的生態系統,部分人工濕地還作為旅游景點,接待游客.(3)在污水處理中,人工濕地通常作為二級或三級處理工藝,研究發現,即使作為三級污水處理工藝,人工濕地中仍可檢測出一定數量的沙門氏菌和產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)[4].(4)人工濕地基質是污水中病原微生物的匯,在特殊情況下,人工濕地有可能成為周圍環境病原微生物的源,并以微生物氣溶膠形式傳播[5].(5)研究表明,自由表面流人工濕地細菌氣溶膠和真菌氣溶膠易進入肺部的細菌和真菌氣溶膠(0.65～4.7μm)顆粒數分別占總數的22.2%～62.3%和54.2%～87.6%[6]. (6)除生活污水外,人工濕地內恒溫動物和鳥類糞便也可能成為病原微生物的源,并且存在季節性變化,有較大的不確定性.(7)人工濕地植物葉片可以成為真菌孢子棲息和繁殖場所,使得人工濕地既是真菌孢子的匯也是周邊環境的源[7].

目前,國內外一些學者已在污水處理系統空氣微生物檢測、曝氣系統對微生物氣溶膠影響、不同處理單元微生物氣溶膠濃度變化、工藝改造對微生物氣溶膠的影響、微生物氣溶膠季節變化及控制措施等領域開展了一些工作[8-17].這些研究大多采用傳統微生物培養方法,由于“可培養類”僅占空氣微生物總數的不到1%[18-19],并且還有部分微生物處于活的不可培養狀態,同時培養結果受培養基組分影響較大,導致測得的數據與實際情況有較大偏差.相對于純培養法,分子生態學手段能夠克服上述缺陷[20],但目前尚未見到利用分子生態學手段研究人工濕地空氣微生物群落結構的報道.

本研究以自由表面流人工濕地污水處理系統為研究對象,通過構建 16S/18S rDNA基因文庫,對春季空氣細菌和空氣真菌群落結構組成和系統發育進行分析,確定優勢菌群,明確其中致病菌及條件致病菌種類,以期為其環境衛生評價提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究地點概況

人工濕地污水處理系統位于山東省青島市,東面和南面臨黃海,西面為人工濕地進水前的倒置A2O預處理區,北面為住宅區.人工濕地為自由表面流蘆葦濕地,由99個并聯運行濕地單元組成,每個單元大小為140m×32m,總占地面積76.7ha,處理規模 3×104m3/d,污水來源為生活污水和工業廢水(約1:1).

1.2 空氣樣品采集

采樣時間為2013年5月,采用KC-6120空氣綜合采樣器采集空氣微生物,空氣流量100L/min,采樣時間持續 3d.采樣結束后取下濾膜,用滅菌生理鹽水沖洗濾膜,使沉積微生物粒子溶于其中,然后12000r/min離心20min,濃縮微生物粒子于2mL離心管,作為實驗樣品備用.

1.3 DNA提取

用DNA提取試劑盒(OMEGA)提取上述樣品中環境總DNA,操作過程參照DNA提取試劑盒說明書.DNA濃度和純度通過Nanodro檢測.

1.4 16S/18S rDNA序列PCR擴增

采用細菌通用引物 27f/1500R[21](上游: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游:5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3');真菌通用引 物 EF4f/EF3r[22](上 游 :5’-GGAAGGGGT GTATTTATTAG-3’;下游:5’-TCCTCTAAATGACCAGTTTG-3’)擴增空氣微生物16S/18S rDNA片段.PCR 反應體系:ddH2O19μL,上游引物(5μmol/L)2μL,下游引物(5μmol/L)2μL,DNA樣品2μL,Master mix 25μL,總體積50μL;PCR反應程序:94℃預變性 5min,94℃變性 45s,58.5退火45s,72℃延伸 90s,共 36個循環;72℃延伸10min;4℃保存.PCR產物用經EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5 16S/18S rDNA克隆文庫構建

用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒(OMEGA)對PCR產物進行回收純化,將純化后的DNA片段通過T4連接酶克隆試劑盒(MBI Fermentas)連接在載體上,轉化到感受態大腸桿菌(Top10)細胞中,涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和 X-Gal的LB(Luria-Bertani)培養基上,37℃培養 16h.隨機選取一定數量白色克隆子,采用菌體直接擴增方式,用pTZ57R/T Vector通用引物M13/PUCR和M13/PUCF擴增外源插入片段,重新獲得16S/18S rDNA片段.菌落PCR擴增程序:94℃預變性5min;94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸1.5min,共36個循環;72℃延伸10min;4℃保存.通過含有EB的1%瓊脂糖凝膠電泳篩選含有插入片段的克隆子,完成克隆文庫構建.

1.6 RFLP分析

用限制性核酸內切酶HhaI(Thermo, FD1854)消化從各克隆子擴增的16S rDNA片段,用限制性核酸內切酶 RsaI(Thermo, FD1123)消化 18S rDNA片段.酶切反應體系:ddH2O5.25μL、10×酶切緩沖液 1μL、PCR產物 3.5μL、HhaI(RsaI) 0.25μL.酶切反應條件:37℃ 20min,80℃ 5min,4℃保存.用含有EB染色的3%瓊脂糖凝膠分離酶切片段,200V下電泳 2.5h,用凝膠成像儀拍照,并對瓊脂糖凝膠電泳圖譜進行分析,將每個酶切分型結果作為一個OUT (operational taxonomic unit).

1.7 多樣性指數分析

表1 克隆文庫多樣性指數與覆蓋度計算方法Table 1 The Formulae for the analysis of genotypic diversity and community coverage

采用覆蓋度(Coverage Value, C)、香農多樣性指數(Shannon Diversity Index, H’)、辛普森指數 (Simpson Index, D)、 豐 富 度 (Species Richness)、均勻度(Species evenness, E)對16S/18S rDNA克隆文庫進行微生物多樣性分析.計算方法[23]見表1.

1.8 測序及文庫分析

根據酶切分型結果,從每個OTU中選取一個克隆子對其插入片段測序.測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成.測序結果在NCBI中利用 BLAST程序(http://www.ncbi. nlm.nih. gov/BLAST/)查找相似序列,分析和鑒定克隆文庫細菌、真菌群落結構組成,并采用MEGA5.0軟件進行細菌、真菌系統發育分析(建樹模型為kimura 2-parameter, bootstrap值為1000).

2 結果與分析

2.1 克隆文庫構建和RFLP分析

人工濕地空氣微生物16S/18S rDNA PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖 1所示.擴增片段長度均在1500bp左右,電泳條帶均一、信號較強,能夠滿足PCR產物膠回收純化要求.

人工濕地空氣微生物16S/18S rDNA克隆文庫部分菌落PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示, PCR片段長度分別為1600bp、1700bp,大部分電泳條帶均一且信號較強,但有少部分菌落 PCR產物電泳條帶信號較弱且不均一,同時也存在一些假陽性克隆.因此,根據菌落 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜,挑選信號較強且均一性好的電泳條帶對應的克隆子,完成克隆文庫構建.

人工濕地空氣微生物16S/18S rDNA基因文庫部分菌落PCR產物酶切產物電泳圖譜如圖3所示.電泳條帶較豐富,且位置差異性較大,能夠達到區分空氣不同類型細菌/真菌的目的.酶切分型結果表明,人工濕地空氣細菌16S rDNA克隆文庫包括190個克隆子,被分為54個OTUs;空氣真菌18S rDNA克隆文庫包括89個克隆子,被分為14個OTUs.

圖1 16S/18S rDNA PCR產物電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S/18S rDNA gene of bacteria and fungi

圖2 16S/18S rDNA克隆文庫部分菌落PCR產物電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S/18S rDNA clone libraries

圖3 16S/18S rDNA克隆文庫部分菌落PCR產物酶切電泳圖譜Fig.3 Partial restriction fragment length profiles of 16S/18S rDNA fragments: The 16S/18S rDNA amplifer was digested with restriction endonucleases and analyzed by agarose gel electrophoresis

2.2 微生物群落結構和系統發育分析

克隆文庫能夠反映研究區域微生物群落結構和種群多樣性,但由于方法本身局限性,其并不能包含實際環境中所有微生物類群,為了明確構建的克隆文庫是否可以準確反映實際環境微生物群落結構組成和種群多樣性,需要計算克隆文庫各種多樣性參數.其中,覆蓋度(C)表示克隆文庫所包含微生物種類占樣品全部微生物種類的比例,其數值越大,表明所構建的克隆文庫越能真實的反映該樣品中微生物多樣性特征;香農多樣性指數(H’)、辛普森指數(D)、豐富度和均勻度(E)等均能從不同側面反映克隆文庫微生物多樣性.表2是人工濕地克隆文庫多樣性參數,可以看出,細菌16S rDNA克隆文庫包括190個克隆子,覆蓋率85.3%,真菌18S rDNA克隆文庫包括89個克隆子,覆蓋率 91.0%,克隆文庫包含了大部分空氣細菌和真菌類群,能夠代表環境樣品微生物多樣性16S rDNA克隆文庫Shannon指數、豐富度指數和均勻度指數均大于 18S rDNA,說明人工濕地空氣細菌多樣性高于真菌,且個體分配均勻性也較高.

根據人工濕地空氣微生物 16S/18S rDNA克隆文庫分析結果(表 3和表 4),構建空氣細菌、空氣真菌系統發育樹(圖4和圖5).人工濕地春季空氣細菌16S rDNA克隆文庫中與已公布的模式菌株有著 81%～99%的相似性,其中, 72.1%克隆子序列能在 NCBI中找到相似度大于 97%的菌株. 18S rDNA克隆文庫中與已公布的模式菌株有著 91%～99%的相似性,74.2%克隆子序列能在NCBI中找到相似度大于97%的菌株.

表2 克隆文庫微生物多樣性及覆蓋度Table 2 Diversity index and coverage in 16S/18S rDNA clone library

表3 人工濕地16S rDNA克隆文庫分析結果Table 3 Inventory of bacterial 16S rDNA cloned fragments in constructed wetlands, arranged in groups according to their sequence similarities

續表3

表4 人工濕地18S rDNA克隆文庫分析結果Table 4 Inventory of fungal 18S rDNA cloned fragments in constructed wetlands, arranged in groups according to their sequence similarities

人工濕地空氣細菌群落具有較高的生物多樣性,分布在 7 個門,包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍藻門(Cyanophyta)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes).其中大部分屬變形菌門中的β-變形菌綱(71.04%)、γ-變形菌綱(12.03%)和α-變形菌綱(3.83%),藍藻門中的藍藻綱(4.38%),厚壁菌門中的芽孢桿菌綱(3.28%),擬桿菌門中的鞘脂桿菌綱(2.19%).此外,還有少量屬浮霉菌門中的浮霉菌綱(1.10%)、變形菌門中的 ε-變形菌綱(0.55%)、放線菌門中的放線菌綱(0.55%)、厚壁菌門中的梭菌綱(0.55%)和綠彎菌門中的厭氧繩菌綱(0.55%)的細菌.

空氣真菌相似度最高的菌株分布在 5個類群中,座囊菌綱(Dothideomycetes61.18%)占絕對優勢,其次是接合菌綱(Zygomycetes16.47%),盤菌綱(Discomycetes14.12%),壺菌綱(Chytridiomycetes5.89%)和糞殼菌綱(Sordariomycetes2.36%)相對較少.

3 討論

16S/18S rDNA克隆文庫法是微生物分子生態學中用來調查環境微生物組成的常用方法之一[24],突破了傳統微生物分離純化方法的局限性,能較全面揭示各種生態環境中微生物多樣性[25].為了客觀反映環境樣品微生物群落結構,構建的克隆文庫應包含環境樣品中所有微生物,即庫容值是100%.但Kemp等[26]分析比較文獻中225個來自多種環境的 16S rDNA組成,發現隨 16S rDNA克隆文庫庫容增大,檢測到的OTU數目總在增加,說明在實際克隆文庫構建過程中,由于PCR反應偏向性等因素影響,克隆文庫不能窮盡樣品中微生物種類和組成,覆蓋度不可能達到100%.本研究中空氣細菌和空氣真菌 16S/18S rDNA克隆文庫庫容值分別為85.3%和91.0%,說明構建的克隆文庫包括樣品中大部分細菌和真菌種類,能夠較好的反映人工濕地空氣細菌和真菌群落結構.克隆子測序結果與 NCBI比對結果顯示,空氣細菌和空氣真菌中分別有 72.1%和74.2%克隆子序列能在NCBI中找到相似度大于97%的菌株.一般認為,原核生物16S rDNA序列3%之內的變異屬于種間變異[27],說明人工濕地空氣微生物中存在部分未被認知的微生物種類.相對于傳統培養方法,構建 16S/18S rDNA克隆文庫方法能夠獲得對空氣微生物群落結構多樣性相對全面的認識,為空氣中未知的微生物純化培養及功能研究奠定基礎.

圖4 人工濕地空氣細菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA clones of airborne bacteria in constructed wetlands

人工濕地利用基質、植物、微生物的物理、化學和生物三重協同作用凈化污水,其空氣微生物群落結構與地理環境、社會環境及人類活動密切相關. 16S rDNA克隆文庫分析結果表明,β-變形菌綱和 γ-變形菌綱屬優勢菌群,說明變形菌門細菌適合大氣環境生長,這與國內外的研究一致[28-30].革蘭氏陰性菌明顯多于革蘭氏陽性菌,符合革蘭氏陰性菌可生活在低溫,甚至嗜冷環境以及對輻射有抗性的結論[31-32].從人工濕地空氣細菌菌屬組成上看,馬賽菌屬(Massilia 66.66%)占絕對優勢,其次是假單胞菌屬(Pseudomonas 4.37%)、藍絲細菌屬(Cyanothece 3.83%)和沙雷氏菌屬(Serratia 3.28%). Massilia以易降解有機物質為底物,屬于生長速度較快的富營養菌[33],當環境中存在足夠碳源和能源時,能夠以高增殖率繁殖,是許多植物土壤根際的優勢菌群[34-45],從戈壁和沙漠表層沙[46]、土壤[47-49]、湖泊(水庫)沉積物[50-51]、垃圾填埋場氣溶膠[52-53]、飲用水[54]中也檢測到其存在,說明人工濕地基質(土壤)是空氣微生物的重要源.假單胞菌在大氣中普遍存在,是寄生于植物的潛在病原菌,表明植被也是人工濕地空氣微生物的源[55].藍絲細菌屬對鹽度具有一定耐受性[56],可能來源于海洋環境.粘質沙雷氏菌則廣泛分布于自然界,是水和土壤中的常居菌群.

圖5 人工濕地空氣真菌系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 18S rDNA clones of airborne fungi in constructed wetlands

人工濕地空氣微生物群落組成與傳統污水處理系統存在一定差異.劉建偉等[16]對北京某污水處理廠研究發現,格柵間空氣中異養細菌種類相對較多,包括芽孢桿菌、大腸桿菌、假單胞菌、葡萄球菌和短桿菌,污泥濃縮池和污泥脫水池優勢異養細菌主要是假單胞菌、大腸桿菌和芽孢桿菌,且在不同時間內在各采樣點所取的樣品中,假單胞菌一直保持優勢地位;余貴英等[17]對污水處理廠反應池、污泥濃縮池、廠前區等功能區微生物氣溶膠研究表明,空氣中主要為大腸桿菌、綠色鏈球菌、枯草芽孢桿菌、不動桿菌、變形桿菌和表皮葡萄球菌,污泥濃縮池主要為大腸桿菌.從本研究的分析結果看,在上述細菌類型中,除假單胞菌為人工濕地空氣細菌優勢菌屬外,其他大部分種類雖然檢測到,但均不占優勢,并且未檢測到大腸桿菌,只檢測到同屬的E.fergusonii.說明人工濕地與傳統二級污水處理系統中空氣微生物來源有較大差異,本研究地點位于海濱區域,空氣微生物構成受到基質、污水、植被、鳥類與恒溫動物、海洋等諸多因素影響,其空氣微生物來源更為復雜.另外,不同研究方法也可能造成空氣微生物群落結構差異.于淼等[6]采用傳統培養方法對自由表面流人工濕地微生物氣溶膠進行研究,發現空氣真菌主要有酵母菌、鐮刀菌屬、枝孢屬、毛霉屬、交鏈孢屬、肉座菌屬、枝霉屬、青霉屬和曲霉屬,而本研究結果表明人工濕地空氣真菌優勢菌屬為核腔菌屬、被孢霉屬、Boothiomyces和緣刺盤菌屬.

人工濕地空氣中存在部分致病菌或條件致病菌.其中,粘質沙雷氏菌(S.marcescens)可引起泌尿系統、下呼吸道、傷口感染及菌血癥,機體抵抗力低下、免疫功能不全、慢性虛弱人群容易感染;表皮葡萄球菌(S.epidermidis)常引起人類呼吸道、傷口、泌尿生殖道、眼部等感染;惡臭假單胞菌(P. putida)是人類重要的臨床病源,已從敗血癥、化膿性中耳炎、角膜鞏膜炎和痢疾樣腹瀉患者標本中分離出該菌;織片草螺菌(H. seropedicae)可導致菌血癥.水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)可以引起水稻白葉枯病,是世界水稻生產上重要的細菌病害之一[57].值得注意的是,盡管前期研究發現人工濕地污水中存在一定數量的沙門氏菌和產氣莢膜梭菌[4,58],從空氣樣品中并未檢測到其存在,為此今后擬采用高通量測序和實時熒光定量PCR等高靈敏度方法進一步研究.

4 結論

4.1 人工濕地春季空氣細菌群落具有較高的多樣性,分布在7個門,其中β-變形菌綱和γ-變形菌綱屬優勢菌群.優勢菌屬為馬賽菌屬、假單胞菌屬、藍絲細菌屬和沙雷氏菌屬.空氣真菌中座囊菌綱占絕對優勢,其次是接合菌綱和盤菌綱, 優勢菌屬為核腔菌屬、被孢霉屬、Boothiomyces和緣刺盤菌屬.

4.2 人工濕地春季空氣微生物中未檢測出大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌,但存在粘質沙雷氏菌、施氏假單胞菌、表皮葡萄球菌等致病菌或條件致病菌.

4.3 人工濕地空氣微生物中存在部分未被認知的種類.采用構建 16S/18S rDNA克隆文庫方法分析污水處理系統空氣微生物群落結構特征,其結果與傳統微生物培養方法存在較大差異.

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致謝：本實驗的現場采樣工作由藏云生工程師等協助完成,在此表示感謝.

Community structure of airborne microbes in spring in a constructed wetland system for sewage treatment.

WU Deng-deng, SONG Zhi-wen*, WANG Lin, XU Ai-ling, XIA Yan (College of Environmental and Municipal Engineering,Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China). China Environmental Science, 2014,34(12)：3164～3174

constructed wetland；airborne bacteria；airborne fungi；community structure；genomic library

X172

A

1000-6923(2014)12-3164-11

吳等等(1988-),女,甘肅省慶陽人,青島理工大學碩士研究生,主要從事環境微生物方面研究.發表論文5篇.

2014-03-20

國家自然科學基金資助項目(31170509)

* 責任作者, 教授, songzhiwen@qtech.edu.cn