3種復合酶法從腸渣中提取肝素鈉的對比研究

孫學超　黃顧林　朱曉雯等

摘要[目的] 為肝素鈉的大規模生產提供依據。[方法] 利用3種復合酶從腸渣中提取肝素鈉，通過測定提取肝素鈉的質量、蛋白含量以及效價對3種復合酶法進行評價。[結果]由木瓜蛋白酶和鏈蛋白酶復合酶提取的肝素鈉中蛋白含量最高（47%），效價為15 USPU/mg；由胰蛋白酶和鏈蛋白酶復合酶提取的肝素鈉中蛋白含量為29%， 而其效價為34 USPU/mg。由2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶提取的肝素鈉中蛋白含量最少（24%），效價最高（39 USPU/mg）。[結論] 2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶能有效提取腸渣中殘留的肝素鈉。

關鍵詞肝素鈉；腸渣；酶解；復合酶

中圖分類號S852文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01074-01

基金項目江蘇省農業科技支撐項目（BE2012400）。

作者簡介孫學超（1987- ），男，山東惠民人，碩士，從事多糖類藥物研究。*通訊作者，高級經濟師，從事腸衣及肝素鈉的經營及相關技術、工藝研究。

肝素主要來源于動物富含肥大細胞的組織（如肝、肺、內腸等），以O-連接形式與核心蛋白（Core protein，CP）形成肝素蛋白聚糖（Heparin proteoglycan，HepPG）形態存在[1]。肝素可以與百余種蛋白（如LDL、VLDL、LPL、SOD、AT Ш、IgG等）相互作用，呈現出降血脂[2]、抗動脈粥樣硬化[3]、免疫調節[4]、抗炎、抗腫瘤[5]、抗單純孢疹病毒[6]、抗凝血[7]等生物活性。肝素于1920年就開始其大規模制備研究，并于1935年應用于臨床，是目前世界上產量和銷售量最大的來自天然的糖類藥物，10 mg肝素鈉能在4 h內抑制500 ml血液凝固[8]，目前還沒有任何一種藥物可以代替它。在肝素生產中，鹽解法具有操作簡單且提取的肝素中雜質少等優點從而被國內有很多的廠家采用，但是鹽解法在高溫使蛋白變性時會包裹肝素鈉形成腸渣，造成了肝素鈉提取率降低的現象，從而帶來損失。腸渣蛋白中既有球狀蛋白亦有鏈狀蛋白，使用單一的酶很難對其酶解徹底。筆者利用3種復合酶對腸渣進行酶解，提取夾雜在腸渣中的肝素鈉，從而為企業大規模生產提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料供試腸渣取自南通天龍畜產品有限公司；綿羊血漿購自蒼山向明生化助劑廠；肝素鈉標準品和標準牛血清白蛋白（BSA）（美國Sigma公司），2709堿性蛋白酶（≥100 000 U/g），購自北京博士奧生物科技有限公司）；胰蛋白酶（≥250 000 U/g），購自美國Sigma公司；鏈蛋白酶（≥7 000 U/g ），購自美國Sigma公司；木瓜蛋白酶（≥3 000 U/g），購自美國Sigma公司；乙醇、丙酮和氫氧化鈉等常規試劑均為國產分析純。

1.2主要儀器R200型旋轉蒸發儀（瑞士BCHI公司）；數顯恒溫水浴鍋（上海華康實驗儀器有限公司）；BT25s分析天平（德國Sartorius公司）；UNIQUER20純水儀（銳思捷科學儀器有限公司）；UV2102 PCS 紫外可見分光光度計（日本尤尼柯公司）；真空干燥箱（化康實驗儀器廠）；082恒溫磁力攪拌器（上海梅潁浦公司）；TDL40B型離心機（安亭科學儀器廠）。

1.3試驗方法

1.3.1木瓜蛋白酶和鏈酶復合酶酶解腸渣。將脫水脫鹽后烘干的腸渣粉碎，過40目篩，取5 g腸渣分散于200 ml TrisHCL（pH 6.5）中，加入木瓜蛋白酶0.5 g，60 ℃保溫攪拌2 h，調節pH至7.5，補加鏈蛋白酶0.1 g，55 ℃保溫2 h，將溫度升至100 ℃并保溫10 min，離心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，濃縮后醇沉，乙醇脫水后真空干燥得到MT。

1.3.2胰蛋白酶和鏈蛋白酶復合酶酶解腸渣。取5 g腸渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.5 g，40 ℃保溫攪拌2 h，調節pH至7.5，補加鏈蛋白酶0.1 g，55 ℃保溫2 h，將溫度升至100 ℃并保溫滅活10 min，離心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，濃縮后醇沉，乙醇脫水后真空干燥得到YT。

1.3.32709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶酶解腸渣。取5 g腸渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.1 g，40 ℃保溫攪拌2 h，調節pH至9.0，補加2709堿性蛋白酶0.5 g，55 ℃保溫2 h，將溫度升至100 ℃并保溫滅活10 min，離心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，濃縮后醇沉，乙醇脫水后真空干燥得到JT。

1.3.4蛋白含量及效價的測定。采用Folin-酚法測定粗蛋白含量[9]。采用美標法測定樣品效價。估測樣品效價，并將其配成8 USPU/mg的供試溶液，然后取管徑均勻、干凈的具塞試管，加入梯度濃度的效價為8 USPU/ml的肝素鈉標準品溶液和供試品溶液，并加入羊血漿1.00 ml和0.25 %氯化鈣試液0.80 ml，塞蓋，搖勻使試管內壁完全潤濕后立即計時，37 ℃條件下放置1 h后，觀察并記錄各管凝血狀況，并按照以下公式計算供試液的效價：

效價=肝素鈉標準品V1/2供試液V1/2×估計效價

2結果與分析

MT、YT和JT均是通過酶解后通過截留分子量為3 500 Da透析袋透析完全。由表1可知，MT、YT和JT的蛋白含量分別為47 %、29%和24%（蛋白含量標準曲線見圖1），說明2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶較前2種復合酶更能解斷腸渣中蛋白，但其蛋白含量還有24 %需要運用其他方法進一步純化；MT、YT和JT的效價分別為15、34和39 USPU/mg，說明蛋白會影響肝素的效價。如果MT、YT和JT中只含蛋白和肝素，效價會遠遠高于39 USPU/mg，據此推測MT、YT和JT中不僅含有肝素及蛋白或許有軟骨素類透明質酸等抗凝活性較弱的糖類，有待進一步研究。腸渣酶解后的酶解液提取完肝素后直接噴霧干燥獲得低分子量的腸膜蛋白。

3小結

筆者探討了以木瓜蛋白酶和鏈蛋白酶復合酶、胰蛋白酶和鏈蛋白酶復合酶以及2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶3種復合酶對腸渣進行分解提取肝素鈉，并對MT、YT和JT的質量、蛋白含量以及效價進行測定，其中由2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶提取的肝素（JT）中蛋白含量最低（24%），效價最高為39 USPU/mg，為以腸渣為原料提取肝素以及生產腸膜蛋白的大規模生產提供依據。

參考文獻

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