宮頸癌篩查方法的研究進展

李娟 田亞平

【摘 要】宮頸癌篩查對降低宮頸癌的發生率和死亡率至關重要。目前實驗室方法已不局限于細胞學方法，還包括了高危型人乳頭瘤病毒檢測、陰道鏡檢測等，隨著將生物技術的發展，也產生了一些生物標志物，可能作為細胞學、高危型人乳頭瘤病毒檢測篩查宮頸癌的補充。本文對目前這些方法在宮頸癌篩查中的應用情況和各自的局限性作一綜述。

【中圖分類號】R737 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）04-2065-02

子宮頸癌是全球女性第三大最常見的癌癥，次于乳腺癌和結腸癌。在亞洲，子宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二種常見惡性腫瘤。在2012年，美國約有新發病例數12，200，死亡4200[1]。在美國，宮頸癌的發病率在降低，但是在西班牙、拉丁美洲和亞洲女性仍發病率很高。2004年，我國宮頸癌新增病例數13.15萬，死亡5.3萬，近年來我國局部地區的發病率和死亡率有增長趨勢， 部分地區患病呈現“年輕化”趨勢，給社會帶來了巨大的健康負擔和經濟負擔。

高危型人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus infection，HPV）的持續感染被認為是宮頸癌發生的主要因素。HPV病毒可以整合到宿主的染色體，編碼E6和E7蛋白，通過抑制P53和Rb蛋白的作用參與宮頸癌的形成[2]。癌癥可以通過預防達到有效控制，一級預防包括避免已知的危險因素，宮頸癌癌癥是由HPV感染引起，接種高危型HPV疫苗可以降低宮頸癌的發病率，如果條件許可，男性也可以包括在內。二級預防包括通過早期篩查及早發現和治療[3]。目前宮頸癌的實驗室方法有很多， 本文對目前這些方法在宮頸癌篩查中的應用情況和各自的局限性作一綜述。

子宮頸癌二級預防的目的是通過早期篩查及早檢測和治療。宮頸癌篩選常用的方法包括細胞學方法、HPV檢測法、陰道鏡檢查還有其他檢查方法。

1 細胞學方法

宮頸細胞學檢查一直是自1940年以來宮頸癌篩查的標準方法，但該技術在早期不同研究中靈敏度和特異性各異。

1.1傳統巴氏細胞涂片 PAP

宮頸細胞學檢查最早由Papanicolaou70年前引入的，稱為PAP test，可以檢測宮頸癌或CIN的細胞變化。檢查結果異常的婦女再經陰道鏡檢查。常規細胞學檢查 宮頸癌（巴氏試驗）是一個 有史以來最成功的宮頸癌篩查試驗。盡管Pap smear已經大量降低了宮頸癌的發生率，但是該法并不完善，主要是由于受到取材、制片、染色及閱片技術等主觀因素的影響，假陰性率高、敏感性低，易造成漏診等現象[4]。1995年的一個Meta分析表明傳統的巴氏涂片的平均靈敏度為58%（范圍11-99%），特異度為69%（14-97%）[5]。

1.2液基細胞學

液基細胞學（LBC）在20世紀90年代被引入，改善了傳統巴氏涂片采樣、制片、閱片等問題，具有較高的特異性和陽性預測值。液基細胞學的優點是：提高了樣本的收集率、降低了不合格涂片的數量、可以自動閱片等，不僅可以做細胞病理學檢查還可以用于后續液基細胞學HPV DNA檢測。液基細胞學檢查已被廣泛用于宮頸癌的篩查，但是關于液基細胞學的靈敏度和特異度也存在一定異議。在一個意大利隨機對照研究顯示，LBC與傳統巴氏涂片相比，對CIN1有較高的靈敏度，對CIN2的靈敏度類似或者降低，但液基細胞學檢查的陽性預測值較低。然而在荷蘭的一項大型隨機試驗的研究結果并沒有顯示出這兩種方法在靈敏度或陽性預測值之間有顯著差異[6]。但在發展中國家，存在從基礎設施落后、訓練有素的細胞學技師較少等問題，且價格也比傳統的巴氏涂片較昂貴，由此限制了液基細胞學的廣泛應用。

2 肉眼觀察法VIA

VIA是檢測浸潤前宮頸癌的方法， 由受過培訓的醫務人員簡單地完成。該過程包括用3-5%醋酸浸泡子宮頸約1分鐘然后用肉眼觀查顏色變化。一個Meta分析表明，VIA有79-82%的靈敏度，91-92%的特異度及8-9%的假陽性率[7]。適當的情況下（非妊娠婦女異常病灶<子宮頸的75%，損傷程度小于2 mm的冷凍探針，或不進入宮頸管），可以在一次檢測中立即用冰凍療法對患者進行治療[3]。一個印度的大型群隨機試驗研究顯示，經過一輪VIA篩查，宮頸癌的發病率（危險比0.75，95%CI為0.55-0.95）和死亡率（0.65，0.47-0.89）降低了[8]。在一個對巴氏涂片、VIA和HPV DNA檢測方法的對比研究中發現，VIA是35-55歲間隔5年并立即治療的婦女是最便宜和拯救患者數量最多的方法[9]。2002年，喬友林等在中國山西省同時采用六種篩查方法對1997名婦女的篩查中，發現VIA法雖然靈敏度與特異度較HPV DNA檢測法、Thinprep法低，但與陰道鏡相比并無顯著性差異，可至少檢測出2/3以上的宮頸高度病變，是一種簡便、低廉的篩查宮頸癌及癌前病變的檢測手段。進行篩這種技術的局限性在于，在一些婦女的鱗柱相接處不能充分觀察到，特別是在更年期。在一些資源有限，特別是細胞學篩查率較低的地方非常有用。

3 HPV testing

高危型HPV的持續感染是宮頸癌發生的必要條件，hpv testing 可以用來篩查宮頸疾?。?0）。最常用的是信號放大（雜交捕獲）和靶標擴增（PCR）兩種方法。與靶標擴增法相比，雜交捕獲通常靈敏度較低，但特異度更高。HPV DNA檢測是一個主要篩選試驗，如用于細胞學異常后分類或與細胞學方法協同測試。HPV DNA檢測有66-100%的敏感度和 1-96%的特異度。一個2011年的Meta研究報道，HPV檢測雖然敏感度很高，但是與比細胞學檢測相比對CIN2-3檢測的特異度低[11]。一項對歐洲四個隨機對照的隨訪研究比較了人乳頭瘤病毒（HPV）篩查和細胞學篩查對預防浸潤性宮頸癌的相對效果， HPV篩查與細胞學檢查相比，對浸潤性宮頸癌提供了更多的60-70%的保護。該規模的隨機臨床試驗支持，應該從30開始HPV篩查年，并可延長至少5年篩查間隔[12]。一個在印度農村地區大型群隨機試驗，通過衡量單輪HPV DNA檢測、細胞學篩查、VIA檢測和不篩查對宮頸癌發病率和死亡率的影響，發現單一細胞學篩查和VIA 篩查與對照組相比對宮頸癌的發病人數和死亡人數之間無顯著差異，而單一HPV檢測與晚期宮頸癌新發病例和死亡人數顯著下降有關[13]。在一個荷蘭的成本效益研究發現， HPV DNA與細胞學協同檢測的方法是目前從社會角度看性價比最高的篩查策略。研究者發現增大篩查的時間間隔，將首要做細胞學檢測改為HPV檢測，可以提高該國家宮頸篩查的有效性[14]。

但是，HPV DNA檢測的成本對于發展中國家仍較高；現在也在研究便宜的HPV DNA檢測方法。在中國農村的一項研究結果表明，一種低成本的HPV 檢測方法（care HPV； QIAGEN， Gaithersburg， MD， USA）達到了與雜交捕獲2（QIAGEN Inc， Gaithersburg， MD， USA）相似的準確度，敏感性 90.0%，特異度為84.2%[15]。

然而，多數HPV感染是短暫的，一個HPV陽性的婦女有較低的風險進展為癌前病變和癌癥。識別宮頸癌癌前病變并進行治療是十分重要的，但對暫時有HPV病毒感染進行反復轉診則是不必要的。如何更好地管理HPV陽性患者目前還不清楚。各國在做HPV篩查時需要更多考慮后勤方面的問題，如建立HPV篩查試驗的類型，確定適當的篩選年齡和時間間隔，確定HPV陽性婦女的管理政策等。在HPV檢測陽性的情況下，需要制定一定的策略決定哪些HPV病毒陽性患者需要轉診進行陰道鏡檢查。在決定哪些策略用于HPV陽性患者分流時有幾個因素需要考慮。

首先，分流試驗陽性表示 HPV陽性的有多少比例需要轉診進行陰道鏡檢查。二，基于分流后檢測結果的陽性結果和陰性結果導致的絕對風險和個體風險的不同管理的是否得到了保證。最后，結果為陰性的個體縱向風險顯示其安全的測試時間間隔[16]。第一個縱向研究數據發表在柳葉刀腫瘤學上面， Francesca Carozzi及其同事將P16-INK4A細胞學檢查作為HPV陽性的分流實驗的新技術進行宮頸癌篩查。他們的結論是，p16基因的過度表達是CIN2（或發展為）或更壞階段的HPV陽性的婦女的一個標志物，尤其是在年齡35-60歲之間的?？梢詫PV陽性婦女進行p16基因檢測，HPV陽性且P16陽性的婦女需立即用陰道鏡檢查，若檢測結果為陰性，可每年隨訪。應避免對HPV陽性和p16蛋白陰性的婦女立即進行陰道鏡檢查， p16陰性的婦女有2-3年的安全時間間隔[17]。

作為二級預防，在一些只具備有基礎資源的國家，30歲至45歲之間的女性應該每隔5-10年進行一次VIA篩查。在資源有限的地區，VIA應該從30-45歲開始，每5年篩查一次，對于陽性結果的應該同時進行傳統巴氏涂片篩查，或5-10年進行一次低成本的HPV檢測。 在資源豐富的地區，液基細胞學檢查可以替代傳統的巴氏涂片與HPV協同檢測。在擁有最大化資源的國家，液基細胞學與HPV篩查可以每5年進行一次。

4 陰道鏡檢查

陰道鏡引導下活檢和錐形活檢組織學檢查宮頸組織，放大10-40觀察宮頸和陰道上皮部位，可觀察到肉眼看不到的微小病變，還可在陰道鏡定位下作活組織檢查，是臨床上輔助診斷宮頸癌及癌前病變的重要方法。研究表明，陰道鏡診斷準確性高，但是由于操作不方便和侵入性，將它們用于宮頸癌的大規模篩查不太現實。國際婦產科聯合會主要采用陰道鏡、活組織檢查、宮頸錐切術、膀胱鏡檢查、直腸乙狀結腸鏡檢查等方法用于宮頸癌分期。

5 其他檢查

預計在不久的將來高危型人乳頭狀瘤病毒（HR-HPV）檢測將成為在一些國家宮頸癌篩查的主要方法。然而，只有一小部分HR-HPV陽性女性有臨床相關的病變。因此，目前迫切需要額外的生物標記物，可以與細胞檢查一起同時檢測這些病變。發展非侵入性的具有高靈敏度的分子生物標志物，可以補充和完善宮頸癌的篩查策略[18]。

5.1 p16 INK4a

P16-INK4a，是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，其表達受到RB1基因產物的負調節。通常情況下，P16-INK4a蛋白在健康細胞中表達非常低，而在宮頸癌細胞系過表達，這是由于RB功能受到高危型HPV E7蛋白的抑制[18]。 因此，通過免疫染色或酶聯免疫吸附測定（ELISA）的p16的過度表達，不僅可以認為是受到HPV病毒感染的標志物，也是病毒性癌基因表達激活和病毒誘導的細胞周期失調的標志物，這使得其可以成為對HPV-DNA陽性的婦女分流的候選標志物[19]。Carozzi F 等對24 661 例HPV陽性的婦女的一個多中心隨機對照研究中，發現與常規細胞學檢查相比HPV檢測與P16-INK4A分流的策略顯著增加了篩查的敏感性[19]。

5.2 methylation status of the promoter regions of CADM1 and MAL

持續感染高危型HPV感染導致子宮頸癌發生，但是從癌前病變發展到浸潤癌的過程也需要遺傳和表觀遺傳的改變。DNA甲基化是宮頸癌發生的一種早期的和常見的分子改變[20]。在宮頸癌形成過程就很易見到HPV長控制區（LCR） 和 L1 基因的甲基化。啟動子甲基化誘導的CADM1 （細胞粘附因子）、MAL（淋巴細胞成熟相關蛋白）、microRNA-124-2 的基因沉默在也宮頸癌的形成過程中發揮作用[21]。在嚴重的宮頸疾病中可以檢測到這些基因存在高度甲基化[22]。Hesselink AT開發了一個的甲基化標記模型（CADM1-m18 和 MAL-m1），在高危型HPV陽性婦女中，與單獨細胞學檢查或細胞學加高危型HPV（HPV16/18）基因分型一樣的區分CIN3（+）[23]。這為宮頸癌篩查提供了一個潛在的客觀的、非形態學的分子生物學檢測方法。

5.3 循環RNA

循環RNA最早在鼻咽癌和黑色素瘤患者的血漿和血清中檢測到[24]，隨后也在其他癌癥患者血液中檢測到。與循環DNA相比，循環RNA的靈敏度和組織特異性更高[25]，在一些疾病中，發現循環RNA與疾病的預后相關[26]。血液中可檢測的、穩定RNA的出現使得循環RNA可以成為一種非侵入性的的標志物，用于疾病的早期診斷、預后和監測治療效果。Xin Zhang等用R T-qPCR 方法檢測了109例宮頸癌患者、 138例 CIN患者 和80明健康對照血清中循環Bmi-1 mRNA 水平，發現宮頸癌組的Bmi-1 mRNA 水平顯著高于疾病對照組和健康對照組，Bmi-1 mRNA與SCC和CA125相比具有更高的診斷能力，且他們發現Bmi-1 mRNA 水平升高與宮頸癌的總生存率和無進展生存率降低相關，他們認為Bmi-1 mRNA有可能成為宮頸癌診斷和預后的分子標志物[18]。

5.4 循環miRNA

MiRNA，是一類小分子RNA，已發現其參與調節細胞增殖、細胞循環、分化、凋亡等生理過程。研究發現miRNA在很多疾病存在異常表達，如糖尿病、心腦血管疾病和癌癥等[27]。已在很多研究中觀察到宮頸癌的miRNA表達譜相對于正常對照發生了改變。如與正常對照相比宮頸癌組織中miR-143和 miR-145的表達降低[28]，而Wang等進一步發現miR-143和 miR-145表達水平在宮頸癌組織和HPV感染的腫瘤前期病變組織降低，表明了miR-143和 miR-145水平早于癌癥的發生[29]。Zhu YK等發現由HPV直接或間接導致的致癌蛋白E6、E7和E5使大量miRNA如miR-34a、miR-218、miR-29A和miR-146a等表達失調，繼而導致宮頸癌的發生和發展[30]。不僅在宮頸癌組織或細胞中可以觀察到miRNA表達譜發生變化，在血液中，Yu J等用實時熒光定量PCR方法檢測了90例宮頸癌患者和50例健康對照miR-218的表達水平，發現大對數宮頸癌患者中miR-218的水平下降且與腫瘤的浸潤相關[31]。目前已有研究認為血清或血漿腫瘤衍生的miRNA是可以成為潛在的血液標志物，用于人類癌癥的檢測，尤其是在早期階段[32]。Zhao S等發現宮頸癌患者血清miR-20a和miR-203水平顯著高于健康對照，且與淋巴結轉移相關，預示它們有可能成為宮頸癌患者淋巴結是否轉移的標志物[33]。目前，宮頸癌相關的miRNA仍處于起步階段，需進一步研究已知的或新的miRNA在宮頸癌發生機制中的作用，并探討它們在宮頸癌診斷和預后方面的臨床價值。

雖然這些生物標志物非常有前途，可能用于宮頸癌的輔助診斷，但尚無研究評估這些生物標志物進行分類或預測的結果的準確性。還需要更多的臨床試驗，以確定這些有潛在作用的細胞學生物標志物的真正的臨床價值。

總之，目前宮頸癌的篩査方法中，細胞學檢查仍是我國宮頸癌篩查的主要方法，考慮到我國目前尚無宮頸癌疫苗，宮頸癌篩查仍面臨巨大壓力。急需建立完善的國家宮頸癌篩查策略，補充并完善其他輔助診斷方法，提高宮頸癌的總體篩查效率從而降低宮頸癌的發生率和死亡率。

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