雙側乳腺癌CA15—3和CK5/6蛋白表達及克隆關系

劉勤 楊偉明　楊雪峰 任宇 蘇曉玥 陳夢婷 霍金龍

【摘 要】目的：探討CA15-3和CK5/6在雙側乳腺癌和單側乳腺癌的表達特點，分析雙側乳腺癌首發癌和第二癌的克隆關系。方法：收集雙側乳腺癌蠟塊標本9例，同時隨機選取2012年10例單側乳腺癌作為對照。運用免疫組化法（Envision法）檢測CA15-3和CK5/6在雙側乳腺癌首發癌、第二癌和單側乳腺癌的表達。結果：雙側乳腺癌首發癌、第二癌和單側乳腺癌CA15-3的表達率分別8/9（88.9%）、7/9（77.8%）、8/10（80%）。雙側乳腺癌首發癌、第二癌和單側乳腺癌CK5/6的表達率分別6/9（66.7%）、7/9（77.8%）、8/10（80%）。雙側乳腺癌CA15-3首發癌和第二癌同時陽性有8例。同時陰性0例。雙側乳腺癌CK5/6首發癌和第二癌同時陽性有6例。同時陰性1例。結論：70-90﹪雙側乳腺癌首發癌和第二癌是單克隆關系。

【關鍵詞】雙側乳腺癌；CA15-3；CK5/6

【中圖分類號】R737.9 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）04-2119-02

原發性雙側乳腺癌左右兩側癌受到類似的激素環境和遺傳因素的影響，可能顯示出類似的生物學特性[1]。原發性雙側乳腺癌先發生側為首發癌，后發生側為第二癌。若同時發現，則腫塊大者為首發癌，另一側為第二癌。第二癌是新發癌即多克隆還是首發癌的轉移即單克隆，一直是許多學者研究的熱點[2，3]。本研究擬通過觀察臨床病理類型和CA15-3、CK5/6在雙側乳腺癌和單側乳腺癌的表達特點及雙側乳腺癌首發癌和第二癌表達的差異，來揭示首發癌和第二癌的克隆關系。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 收集遵義醫學院附屬醫院2007年1月1日-2013年1月10日共收治雙側乳腺癌9例臨床病例資料，同時隨機選取2012年10例單側乳腺癌作為對照，均為女性，所有蠟塊組織均經病理科證實為乳腺癌（見圖A）。

1.2 臨床資料 本組病例雙側乳腺癌發病年齡37歲～54歲，平均年齡45歲，絕經前7例，絕經后2例。9例雙側乳腺癌均有生育史，其中3例有家族史：1例母親患乳腺癌，1例姐姐患乳腺癌，1例父親患肝癌。10例單側乳腺癌發病年齡34-54歲，平均年齡47歲，絕經前3例，絕經后7例，10例單側乳腺癌患者無家族史。

1.3 病理類型和TNM分期 雙側乳腺癌首發癌中浸潤性導管癌7例，浸潤性小葉癌1例，導管內癌1例。第二癌浸潤性導管癌 4例，浸潤性小葉癌2例，原位癌3例。9例雙側乳腺癌首發癌和第二癌TNM分期為0期或Ⅰ期：首發癌9例為Ⅰ期，第二癌6例Ⅰ期，3例0期。9例雙側乳腺癌中，首發癌和第二癌在病理類型有6例表現出一致性，TNM分期上表現出一致性[4]，并且兩側癌中都已浸潤性導管癌為主（見表1）。

1.4 檢測方法和試劑 所有病例標本均經10% 福爾馬林溶液固定， 常規石蠟包埋， 連續4μm 厚切片， 行Envision法免疫組化染色：二甲苯梯度脫蠟兩次，每次10min，乙醇梯度水化，3%雙氧水浸泡10min去除內源性過氧化酶，CA15-3檸檬酸修復，CK5/6EDTA微波修復抗原，自然冷卻后PBS液沖洗3次，每次兩分鐘，滴加牛血清封閉液封閉45分鐘，加一抗室溫放置一小時，再次PBS液沖洗三次，每次兩分鐘，滴加二抗，室溫放置15min，最后PBS液沖洗3次，每次兩分鐘。DAB顯色，蘇木素復染細胞核，乙醇梯度脫水，透明，中性樹膠封片。鼠抗人乳腺癌相關抗原（CA15-3） 單克隆抗體（工作液濃度 1︰100）和鼠抗人CK5/6單克隆抗體（工作液濃度 1︰100）均購自北京中杉金橋公司。二抗試劑盒購于美國基因公司。CA15-3用已知陽性的乳腺癌組織切片做陽性對照（見圖B），CK5/6用正常皮膚組織切片做陽性對照（見圖C），以PBS 代替一抗做陰性對照（見圖D）。

1.5 結果判斷 CA15-3陽性染色部位為細胞膜或細胞漿（見圖E-G），CK5/6陽性染色部位為細胞漿（見圖H-J）。以染色部位出現棕黃色或棕褐色為陽性表達，每張切片選取10個不同部位，400倍視野進行拍攝。參照許良中等的方法[5]每張切片陽性細胞的著色強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別評分0、1、2、3 分。根據陽性細胞在所觀察細胞（ 100 個） 中所占比例評分：陽性細胞數< 5% 為0 分，6% ～ 25% 為1 分，25% ～ 50% 為2 分，> 50%為3 分。然后根據兩項評分之和判斷其結果： 0 分為（ - ） ， 2 分為（ +） ， 3～4 分為（ ++） ， 5～6 分為（ +++） 。（ - ） 為表達陰性； （ +） 為低表達； （ ++） ～（ +++）為高表達。

2 結果

2.1 CA15-3和CK5/6在雙側乳腺癌的表達 CA15-3和CK5/6在雙側乳腺癌的表達：免疫組化結果顯示：CA15-3表達于乳腺癌細胞的細胞膜或細胞漿，以細胞膜或細胞漿出現棕黃色或棕褐色網格狀陽性染色為主。CK5/6表達于乳腺癌細胞的細胞漿，以細胞漿染成棕黃色或棕褐色網格狀為陽性表達。雙側乳腺癌首發癌和第二癌CA15-3表達同時陽性有8例。同時陰性0例。原發性雙側乳腺癌首發癌和第二癌CK5/6表達同時陽性有6例。同時陰性1例。

注：A：乳腺癌組織HE染色；B：CA15-3陽性對照圖；C：CK5/6陽性對照圖；D：PBS代替一抗陰性對照圖；E： CA15-3在雙側乳腺癌首發癌的陽性表達；F：CA15-3在雙側乳腺癌第二癌的陽性表達；G：CA15-3在單側乳腺癌的陽性表達；H：CK5/6在雙側乳腺癌首發癌的陽性表達；I：CK5/6在雙側乳腺癌第二癌的陽性表達；J：CK5/6在單側乳腺癌的陽性表達

圖1 圖A為乳腺癌組織HE染色，×400 圖B-J免疫組化法（Envision法），×400

2.2 CA15-3和CK5/6在雙側乳腺癌和單側乳腺癌的表達

雙側乳腺癌首發癌和第二癌CA15-3表達同時陽性有8例。同時陰性0例。雙側乳腺癌首發癌和第二癌CK5/6表達同時陽性有6例。同時陰性1例。CA15-3和CK5/6在10例單側乳腺癌的表達率分別為9/10（90%）和8/10（80%）可見雙側乳腺癌首發癌和第二癌絕大多數CA15-3和CK5/6的蛋白表達一致，并且與單側乳腺癌的表達沒有明顯差別。即雙側乳腺癌的兩側癌可能來源于同一乳腺癌干祖細胞。

3 討論

腫瘤標志物是繼影像學診斷和病理診斷之后最常用的腫瘤診斷方法之一。CA15-3為癌抗原，是乳腺細胞上皮表面糖蛋白變異體，對乳腺癌有明顯的器官特異性，對乳腺癌的早期診斷和術后療效檢測均有十分重要的臨床價值。是監測乳腺癌患者術后復發的最佳指標，其含量變化與治療結果相關[6]。細胞角蛋白（CKs）來源于上皮組織，由20個成員組成，CK5/6是其中的一個成員，是一種基底細胞型角蛋白[7]。CK5/6是表達與basal-like表型乳腺癌中的一個特征性標志物，是乳腺癌獨立的預后指標[8]。用CA15-3和CK5/6聯合檢測原發性雙側乳腺癌首發癌和第二癌的表達差異，更具有臨床研究意義。

乳腺癌是一個成對的器官容易受到相同的環境和激素的影響。乳腺可以比作一對“雙胞胎”。關于雙胞胎的研究是假定單卵雙胎是完全一樣的，在單卵雙胎和異卵雙胎之間比較一些特征和疾病的一致性首先要承認遺傳因素和環境因素的影響[8]。本實驗研究表明，大部分原發性雙側乳腺癌是在絕經前發病，通過運用免疫組化來檢測左右兩癌的蛋白表達差異。表明原發性雙側乳腺癌首發癌和第二癌CA15-3和CK5/6的表達相似，說明兩癌可能來源于同一乳腺癌干祖細胞。原發性雙側乳腺癌首發癌和單側乳腺癌之間的蛋白表達亦無差異，表明CA15-3和CK5/6在雙側乳腺癌和單側乳腺癌的表達無區別，雙側乳腺癌的惡性程度和單側乳腺癌的惡性程度相似。雖然乳腺是成對器官，但乳腺的成長來自各自的原始乳芽。在成長過程中雙側乳腺易受到類似的遺傳因素、環境因素和激素的影響。有蛋白表達就一定有相應的基因，而有基因不一定存在蛋白表達。左右兩側乳腺癌蛋白表達相似，應該有相同的基因，進一步表明兩個癌灶可能來源于同一癌細胞。

我們的研究表明70-90﹪雙側乳腺癌左右兩側癌有一致病理類型和蛋白表型特征，說明雙側乳腺癌的首發癌和第二癌是單克隆來源。而有極少部分表型不一致，可能是因為在癌灶的生長過程中發生了基因突變，從而導致蛋白表達有相差性。因此，我們接下的研究是從組織中提取RNA，逆轉錄成CDNA，經上下游引物擴增需要的產物并測序，分析CA15-3和CK5/6基因在雙側乳腺癌左右兩癌有無相同的突變位點。

參考文獻

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[8] Rakha EA，E1-Saved ME，Green AR，et al.breast carcinoma with basal differentiation：aproposal for pathology definition based on basalcytokeratiexpression [J].Histopathology.2007 Mar；50（4）：434-8.

作者簡介：

劉勤，男，住院醫師，1982年12月01日 碩士學位 目前主要從事臨床甲狀腺乳腺外科 研究方向為乳腺癌。

楊偉明，男，三級教授，主任醫師 學士學位 主要從事臨床甲狀腺乳腺工作，研究方向為乳腺癌。