NSF對慢性腎衰模型大鼠微炎癥狀態相關細胞因子影響的實驗研究

趙靜等

【摘 要】目的： 研究NSF對5/6腎切除模型大鼠微炎癥狀態相關細胞因子的影響。方法 ：將SD大鼠72隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組、NSF組，實施5/6腎切除術建立大鼠慢性腎功衰模型；治療組自二次術后第31天起給藥，連續30天。檢測大鼠血Urea、Crea，殘余腎組織病理情況確定模型建立，檢測微炎癥狀態相關細胞因子：血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）的變化。結果： NSF組與模型組比較：Urea、Crea明顯降低 （ P<0.05），腎臟病理改變較輕，血清TNF-α和IL-6的表達明顯降低（P<0.05）。結論： NSF能通過下調5/6腎切除模型大鼠TNF-α和IL-6的表達，改善其微炎癥狀態，延緩慢性腎衰竭的發展。

【關鍵詞】5/6腎切除模型；微炎癥狀態；血清腫瘤壞死因子α；白細胞介素6

【中圖分類號】R285.5 【文獻標識碼】B 【文章編號】1004-7484（2014）04-2165-02

Experimental study on effect of NSF on micro inflammation state related cytokines of CRF model rats

ZHAO Jing1 LIU Weiwei1 LI Xueping1 ZHANG Baocheng1 MI Jun2 GAO Yongxiang1*

（1. Chengdu University of TCM， Chengdu， Sichuan 610075； 2. Nanshan Pharmaceutical Ltd. ， Chengdu， Sichuan 610041）

【Abstract】Objective：To research the effects of NSF on micro inflammation state related cytokines of CRF model rats induced by 5/6 nephrectomy. Methods： 72 SD rats were divided into sham-operated group， vehicle control group， positive control group and NSF groups. Chronic Renal Failure was induced by 5/6 nephrectomy. On the 31st day after the 2nd surgery， the positive control group and NSF groups were administrated for 30 days. The model was evaluated by the content of Urea， Crea in blood serum and renal excisional biopsy. The micro inflammation state related cytokines， such as TNF-α and IL-6 were observed. Results： Compared with vehicle control group， the content of Urea and Crea in NSF groups was significantly lower （P<0.05）， the renal pathological changes was milder， and the secretion of TNF-α and IL-6 was significantly decreased （P<0.05）. Conclusions： NSF could improve the micro inflammation state of CRF model rats， and slow the progression of CRF by down-regulating TNF-α and IL-6.

【Key words】5/6 nephrectomy model， micro inflammation state， TNF-α， IL-6

慢性腎衰竭（CFR）是各型原發或繼發性腎臟疾病后期，以代謝產物和毒物潴留，水、電解質、酸堿平衡紊亂及某些內分泌功能異常為主要表現的臨床綜合征，是各種慢性腎臟疾病終末期的共同表現。其末期治療常依靠維持性血液透析（mainteinance hemodialysis，MHD）或腎臟移植維持生命，給社會、家庭及患者帶來沉重負擔。但即使接受上述治療，透析相關疾病和腎移植后免疫狀態紊亂導致的相關疾病仍嚴重影響患者的長期生存。近年諸多研究發現[1] [2]，微炎癥狀態在MHD患者中普遍存并參與透析相關疾病發生，且微炎癥狀態在CFR 進展惡化中，也發揮重要作用，影響患者預后。中藥地耳草具有保肝、抗菌、增強免疫作用，臨床常應用于肝炎的治療[3]，在腎功能衰竭患者的腎功改善方面也有臨床報道[4] [5]。NSF是地耳草提取的有效成分提取物，本課題組前期研究顯示NSF能延緩慢性腎衰的發展。為進一步研究NSF對CFR治療作用及對微炎癥狀態的影響，探索其對慢性腎衰的防治機制，本研究通過建立5/6腎切除大鼠模型，選取微炎癥狀態相關細胞因子TNF-α和IL-6進行檢測，觀察藥物對腎功能及微炎癥狀態的改善作用。

1 材料

1.1實驗動物 雄性清潔級SD大鼠72只，體重（210±10）g，成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供。常規條件下飼養，自由飲水，普通飲食，適應性喂養7天。

1.2實驗用藥

NSF由成都南山藥業有限公司提供，依照委托單位提供的供試品人臨床擬用劑量（1.2g/人.日）為主要依據，按照體表面積換算成大鼠的等效劑量（人的體重按60kg計）。

金水寶膠囊，江西濟成可信金水寶制品有限公司，批號，20111203，以臨床人用量（0.33g/粒，18粒/人日）經體表面積轉換成大鼠等效劑量作為本實驗劑量。

1.3主要試劑與儀器

全自動生化分析儀：日立7180型；

顯微鏡：德國萊卡顯微鏡，德國萊卡病理圖像分析系統 DM2000；

類標準胎牛血清：中美合資蘭州民海生物工程有限公司 批號：20100424；

雙抗100X：PAA-Strasse1.4061 Pasching .Austria 貨號：P11-010 批號：P01010-1446；

免疫組化試劑盒：生產商：北京博奧森生物技術有限公司，批號： FP-0023；

2 方法

2.1模型制作 大鼠適應性喂養7天，稱重，編號，隨機分為4組，每組選取18只為假手術組，剩余54只采用5/6腎切除術制作大鼠腎衰模型。腹腔注射10%水合氯醛輔以乙醚麻醉大鼠，俯臥固定于手術臺上，局部剪毛，左側肋下脊直肌外側皮膚常規消毒，無菌操作下，切開各層，暴露左腎，分離固定。切開左腎上下兩極包膜，切除上下兩極約單側腎臟2/3，用明膠海綿壓迫止血后縫合各層。腹腔注射青霉素預防感染。術后7天第二次手術，同樣方法麻醉，切開右側背部暴露右腎，結扎腎蒂，全切右腎。

2.2分組給藥 手術操作后的大鼠隨機分為3組，每組18只。分別為模型對照組、陽性對照組、NSF組。所有大鼠于二次手術后第31天開始灌胃給予相應藥物：假手術組和模型對照組以0.5%CMC-Na溶液灌胃，1ml/100g.bw；陽性對照組：金水寶膠囊5.7mg/kg；NSF組：NSF120 mg/kg。連續給藥30天。

2.3 標本收集 用完藥后禁食12h，次日稱重，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血。留取血清做生化檢測及elisa檢測。處死后，取大鼠殘余腎臟組織，置于4%多聚甲醛中固定，備病理學觀察。

2.4檢測指標及方法

2.4.1一般情況觀察 動態觀察造模期間大鼠存活率、進食情況、精神狀態、活動度、皮毛光澤度等。

2.4.2血清Urea、Crea 用藥完成后，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血。留取血清，以全自動血生化分析儀檢測Urea、Crea變化。

2.4.3腎臟組織病理 最后一次給藥后次日，麻醉處死大鼠，取殘余腎臟組織于4%多聚甲醛中固定，修塊后經自動脫水機退水處理、包埋、切片，行HE染色，顯微鏡下觀察腎臟病理改變。

2.4.4血清微炎癥狀態細胞因子TNF-α、IL-6檢測最后一次給藥后次日，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血。留取血清，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6含量。

1.5統計學方法 計量資料以（ ±s）表示，用SPSS17.0統計分析軟件進行非參數檢驗和單因素方差分析。

3 結果

3.1一般情況 實驗期間，正常大鼠全部存活，飲食飲水正常，活動靈活，皮毛光澤。造模處理后各組大鼠均出現死亡，各組存活率分別為：模型組66.67%，陽性對照組55.56%，NSF組77.78%；造模后各組大鼠均出現不同程度進食飲水量下降，精神萎靡惡動，毛色發黃干枯，體態消瘦等。尤其以模型組最為嚴重，治療后，陽性對照組和NSF組均較模型組有一定程度恢復，進食、活動均有增加。

3.2血清Urea、Crea 各組大鼠Urea、Crea增高，與假手術組相比，具有顯著差異（p<0.05），表明造模成功；NSF組、陽性對照組與模型組比較Urea、Crea降低，有顯著差異（p>0.05），表明NSF能降低血Urea、Crea的含量。（表1）

3.3腎臟病理變化 肉眼觀察，造模后殘余腎臟包膜增厚、變硬，表面粗糙部分區域有隆起，切面暗紅，和周圍組織有粘連；鏡下，正常組腎臟腎小體、腎小管及間質未見明顯異常。模型組腎球囊部分臟層上皮細胞增生，囊壁增厚，少數腎小球球囊發生粘連；大部分腎小球系膜細胞增生，基質增生，嗜酸性增強，少量血管球毛細血管腔節段性閉塞，可見毛細血管球內微血栓形成，血管球局部呈均質紅染。絕大多數小管上皮細胞水腫，部分腎小管萎縮消失，部分小管擴張，少數極度擴張呈囊性。小管中可見較多蛋白和細胞管型。腎臟間質慢性炎細胞浸潤，伴纖維組織增生。腎臟包膜增厚，可見均質紅染改變。出現慢性腎衰纖維化的病理改變，病變程度較重，腎衰模型建立成功。

模型對照組比較，陽性對照組和NSF組腎小球囊臟層上皮細胞增生例數較少；腎小體血管球系膜增生程度較輕；變性血管球數量稍少，未見血管球毛細血管腔節段性閉塞；間質炎細胞浸潤例數及纖維組織增生例數較少。腎小管萎縮、擴張病變無改善。可見陽性對照組和NSF組大鼠5/6腎切除殘余腎臟腎小體及間質病變發生率減低。提示NSF對腎臟纖維化有抑制作用，有減輕病變程度的作用。

3.4血清TNF-α、IL-6檢測 ELISA方法檢測外周血中TNF-α、IL-6的含量，結果顯示NSF組、陽性對照組、假手術組TNF-α和IL-6含量均明顯低于模型對照組（P<0.05）；三組組間比較無統顯著差異（P>0.05）。（表2）

4 討論

早在2000年，Schoming等科學家就提出尿毒癥患者體內存在微炎癥狀態（microinf lammatory state）。后續研究發現[6]，原發及各種繼發腎臟疾病均存在機體免疫功能失常，由于腎臟功能逐漸失代償，體內代謝產物蓄積可刺激機體各種炎性因子異常表達，最終機體將處于長期炎癥反應和氧化應激狀態。CFR與微炎癥兩者客觀共存，CFR本身可以導致炎癥應答，誘發炎癥狀態；而微炎癥又是CRF的加重因素，通過多因素多途徑參與并加重CRF病程的進展及其并發癥的發生，加速腎功能的惡化，兩者相互促進，形成惡性循環[7]。微炎癥狀態下，機體發生以單核巨噬細胞系統激活TNF-α、IL-6為主的促炎癥細胞釋放為中心的炎癥反應。國內外研究報道[8] [9]，CRF無論透析或非透析狀態，都存在明顯微炎癥狀態，TNF-α、IL-6等關鍵細胞因子較正常明顯增高；早期發現和干預微炎癥狀態，降低TNF-α、IL-6等細胞因子水平，對慢性腎臟病患者的預后有十分重要的臨床意義。

目前對微炎癥狀態的干預治療仍缺乏一種有效的方法。相關研究報道表明他汀類藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑、受體拮抗劑、左旋卡尼汀、抗氧化劑等藥物的使用，可在不同程度上干預和改善患者的微炎癥狀態。但微炎癥狀態的發生發展中，復雜的細胞信號轉導和信息分子之間對的交叉對話，導致單一因素或單一作用靶點的藥物應用效果并不理想。能通過多靶點、多途徑發揮綜合療效的藥物成為研究熱點。

NSF是中藥地耳草有效成分的提取物。地耳草，又名田基黃、趕黃草，具有利濕退黃、清熱解毒、活血消腫、散瘀止痛等功效。傳統醫學中主要應用于肝炎治療，亦有治療肝硬化的報道。現代藥理學研究，進一步揭示了地耳草的藥理作用包括保肝、抗氧化、治療肝炎、抑菌、抗病毒、調節免疫、抑制腫瘤細胞等。地耳草應用于腎病治療，雖有臨床報道，但未見系統實驗研究。

本課題組前期實驗發現，NSF對慢性腎衰竭模型大鼠有改善腎臟功能的作用，對模型大鼠腎臟纖維化及纖維化相關細胞因子有干預效果。本實驗設計采用5/6腎切除大鼠模型，觀察NSF對模型大鼠腎功、腎臟病理形態學變化，確立藥物對腎衰模型的治療作用；并選取CRF時微炎癥狀態相關的細胞因子指標TNF-α、IL-6進行檢測，探索藥物對腎衰微炎癥狀態的干預作用。

實驗結果顯示腎衰模型成功建立，NSF對該模型大鼠腎臟功能改變及形態學病變均有改善作用；5/6腎切除大鼠模型組血清TNF-α、IL-6表達均增加，與國內外臨床及實驗報道結果一致；而NSF組血清TNF-α、IL-6表達下降，該結果提示NSF能下調模型大鼠TNF-α和IL-6的表達，改善其微炎癥狀態，延緩慢性腎衰竭的發展。在后續實驗中，可考慮加入NSF對微炎癥狀態相關并發癥效應指標的檢測。如NSF對CRF的血脂及血脂相關細胞因子的影響，探索NSF通過改善CRF微炎癥狀態，發揮其對終末腎病常見并發癥動脈粥樣硬化的防治作用。為后續進一步發掘中藥地耳草對慢性腎衰及其并發癥的防治機制，開拓地耳草在疾病治療中的應用領域打下基礎。

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作者簡介：

趙靜（1982— ），女（回族），四川成都人，現任成都中醫藥大學基礎醫學院講師， 610075，研究方向：中藥免疫安全性與有效性評價。

通訊作者簡介：

高永翔（1965— ），男（漢族），四川成都人，現任成都中醫藥大學基礎醫學院教授，博士生導師，研究方向：中藥免疫安全性與有效性評價。