中度嗜鹽菌玁esterenkonia 玸p.DF1產淀粉酶發酵條件優化的研究

張杰　劉永強 婁虎 郭瑞 劉雪峰

摘要

[目的]摸索出Nesterenkonia sp.DF1菌種的產淀粉酶的優化發酵條件，為發酵工業中淀粉酶的大規模生產提供理論依據。[方法] 采用單因素和多因素正交試驗的方法，考察發酵時間、溫度、初始pH、鹽度、碳源和氮源的改變對發酵產淀粉酶的影響。[結果]在裝液量100 ml/250 ml條件下， 得到產淀粉酶最佳條件為：玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0、NaCl濃度3%、37.5 ℃、160 r/min振蕩培養72 h。[結論] 該研究找到了產淀粉酶的最佳發酵條件。

關鍵詞中度嗜鹽菌；淀粉酶；發酵條件；優化

中圖分類號Q938；S188+.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）28-09664-03

Optimizing Fermentation Conditions for Amylase Production Using Moderately Halophilic Bacterium Nesterenkonia sp.DF1

ZHANG Jie1， LIU Yongqiang2， LOU Hu1， LIU Xuefeng3* et al

（1. College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. Daqing City Center for Disease Control and Prevention， Daqing， Heilongjiang 163311；3.Forestry College，Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract[Objective] It was necessary for Nesterenkonia sp.DF1 to optimize the fermentation conditions for production of amylase in order to provide theoretical basis for the mass production of amylase in fermentation industry. [Method] The single factor method and multifactor orthogonal experiment were adopted to investigate the effect of a set of variables， including fermentation time， temperature， initial pH， salinity， the change of carbon source and nitrogen source upon the influence of fermentation to produce amylase. [Result] When liquid medium volume was 100 ml/ 250 ml， the optimal fermentation conditions were corn meal 1%， yeast extraction 2%， initial pH 8.0， NaCl concentration 3%， temperature 37.5 ℃ and shaking culture for 72 h at 160 r/min. [Conclusion] The best fermentation conditions for Nesterenkonia sp.DF1 to produce amylase were obtained.

Key words Moderately halophilic bacterium； Amylase； Fermentation conditions； Optimization

目前國內對于嗜鹽菌產淀粉酶、酯酶、脂肪酶的相關報道很多，但這些菌大多數屬于極端嗜鹽菌，如Halobacterium sp.H371[1]、Halorubrum sp.CY[2]、Haloferax mediterranei R4[3]和Natronobacterium sp.C212[4]等，對于中度嗜鹽菌產生的酶方面的研究還不是很多，而且目前尚沒有對Nesterenkonia屬菌所分泌的胞外淀粉酶進行系統的酶學性質和發酵條件優化研究。該研究彌補了這方面的不足，為發酵工業中淀粉酶的大規模生產提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

菌種。該實驗室分離的中度嗜鹽菌高產淀粉酶的菌種Nesterenkonia sp.DF01。

1.1.2

培養基。種子培養基組成為：酵母粉6 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，蛋白胨6 g/L，KCl 3 g/L，檸檬酸鈉3 g/L， FeSO4 0.001 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L， NaCl 30～120 g/L（不同鹽度梯度），加蒸餾水至1 000 ml。淀粉酶發酵培養基組成為：酸水解酪蛋白5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母粉6 g/L，KCl 3 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，FeSO4 0.001 g/L， MgSO4·7H2O 2 g/L， NaCl視需要量，加蒸餾水至1 000 ml。

1.2方法

1.2.1

單因素試驗。挑取少許單菌落，接種于種子發酵液中， 140 r/min，37 ℃搖床培養 24～48 h，制備種子發酵液，按2%的接種量接種在裝有100 ml淀粉酶發酵培養基的250 ml三角瓶中， 160 r/min，37 ℃搖床培養。分別改變發酵時間、溫度、初始pH、鹽度，碳源和氮源，每個不同梯度樣品作3個平行，取酶活性的平均值[5-6]。

1.2.2

多因素正交試驗。

采用L9（34）做正交試驗，選擇碳源、氮源、NaCl濃度培養基和初始pH作為4個單因素，找出在多個因子共同作用（表1）下的中度嗜鹽菌產淀粉酶的最佳培養條件[7-8]

1.2.3

淀粉酶活性的測定。參照文獻[9]，測定淀粉酶活性。酶活性單位定義為：在最適反應條件下反應10 min，消化1 mg淀粉所需的酶量。

2結果與分析

2.1培養時間對DF01產淀粉酶的影響

由圖1可知，培養0～24 h時菌體生長很慢，淀粉酶活性比較低；培養24～48 h時菌體迅速生長，淀粉酶活性越來越高；培養48～72 h時菌體生長很快，培養72 h時達到最大值，產酶量很高且保持穩定，在培養72 h時也達到最高值；培養72～96 h時菌體生長穩定，接近最大值，菌體培養到84 h之后產酶量緩慢下降；培養超過96 h時菌體生長、產酶量均有下降趨勢，因此培養72 h最佳。

圖1培養時間對DF01產淀粉酶的影響

2.2培養溫度對DF01產淀粉酶的影響

由圖2可知，當溫度超過30 ℃時菌體生長迅速，當溫度達到37 ℃時菌體含量最大，38 ℃時產酶量接近最大值，因此最佳的產酶溫度為37.5 ℃，此時菌體生長良好，產酶量也多。

圖2培養溫度對DF01產淀粉酶的影響

2.3培養基初始pH對DF01產淀粉酶的影響

由圖3可知，當初始pH為7.5時，菌體生長量接近最大值，產酶量呈現上升趨勢；當初始pH為8.0時，產淀粉酶量接近最大值，菌體含量也接近最大值；當初始pH超過8.0時，產酶量和菌體含量均下降。因此，培養基初始pH 8.0對DF01產淀粉酶的影響最佳。

圖3起始pH對產淀粉酶的影響

2.4NaCl濃度對DF01產淀粉酶的影響

由圖4可知，NaCl濃度在0～3%范圍內產淀粉酶量差別不大，當生長鹽度為3%時菌體含量、產酶量菌接近最大值，當NaCl濃度大于5%時菌體含量和產淀粉酶量均下降。因此，NaCl濃度為3%時對DF01產淀粉酶的影響最佳。

圖4NaCl濃度對產淀粉酶的影響

2.5碳源及其濃度對DF01產淀粉酶的影響

由圖5可知，DF01在相同的培養條件下，以玉米粉為唯一碳源配制培養基培養菌體時產淀粉酶量最高，其次是以可溶性淀粉為唯一碳源，當以葡萄糖為唯一碳源時產酶量最低。

圖5不同碳源對產淀粉酶的影響

由圖6可知，碳源的添加量不同，對產淀粉酶會有很大的影響，當碳源玉米粉含量為1%時產淀粉酶量最高，超過1%時產酶量逐漸下降。

圖6玉米粉添加量對產淀粉酶的影響

2.6氮源及其濃度對DF01產淀粉酶的影響

由圖7可知，DF01在相同的培養條件下，以酵母膏為唯一氮源配制培養基培養菌體時產酶量最高，其次以蛋白胨為唯一氮源，當以尿素為唯一氮源時產酶量最低。

圖7不同氮源對產淀粉酶的影響

由圖8可知，氮源的添加量不同，對產淀粉酶有很大的影響，當氮源酵母膏含量為2%時產淀粉酶量最高，氮源含量過高或過低菌種產酶量會下降。

圖8氮源添加量對產淀粉酶的影響

2.7多因子正交試驗分析

由表2可知，四因素對DF01產淀粉酶產生影響的大小順序為碳源濃度>氮源濃度>pH >NaCl濃度。根據正交試驗結果，產淀粉酶最佳條件為玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0，NaCl 濃度3%。

3結論

結合單因素和四因素三水平正交試驗，在裝液量100 ml/250 ml條件下， 得到產淀粉酶最佳條件為玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0，NaCl濃度3%，37.5 ℃，160 r/min振蕩培養72 h。該研究結果為今后中度嗜鹽菌菌種的生產應用提供了理論基礎。