Bcr/abl融合基因在慢性粒細胞白血病中的檢測方法及意義

馮術青　宋旭東

【摘要】bcr/abl 融合基因是慢性粒細胞白血病（CML）發病的分子生物學基礎，通過靈敏的檢驗方法檢測此基因對CML的診斷、治療和預測疾病復發等具有重要臨床意義。

【關鍵詞】 bcr/abl 融合基因；慢性粒細胞白血病

【中圖分類號】R733.72 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0335-01

慢性粒細胞白血病（CML）是一種發生在造血干細胞的以粒系細胞慢性增殖為主要特征的惡性克隆性疾病，分子學水平上形成bcr/abl融合基因。bcr/abl融合基因的表達水平反映了患者體內白血病細胞的負荷量。因此，精確檢測bcr/abl融合基因的表達水平，對白血病的臨床分型診斷、個體化治療方案的制定、治療效果監測、緩解后復發風險的估計和預防、干細胞移植后殘留細胞的檢測和早期干預治療等方面具有重要的指導作用。本文對bcr/abl融合基因的檢測方法及意義進行綜述。

1 Bcr/abl融合基因的檢測方法

1.1 Southern Blot和Western Blot

Southern 印跡即DNA印跡，可以對bcr/abl融合基因DNA重排進行分子生物學檢測。Southern Blot可使用從外周血或骨髓細胞提取的DNA對bcr/abl融合基因進行檢測，不需要保持細胞的活力和所處周期，靈敏度約1～5%，多適用于科研而不是臨床診斷[1]。

Western 印跡的原理類似Southern印跡，它是從混合蛋白質中區分并定量分析某種特殊蛋白質的重要手段[2-3]。但由于不同蛋白質的電轉移效率以及單抗的結合能力不同，Western印跡的敏感性和可重復性較差，其敏感性為0.5%～1%[4]。另外該法操作繁瑣、檢測時間長，限制了其在臨床上的應用。

1.2 常規RT-PCR

1988年RT-PCR被首次應用于CML的bcr/abl基因的檢測[5]。在RT-PCR中，應用隨機引物或abl特異引物，mRNA被反轉錄為cDNA，隨后應用針對M-bcr的bl或b2和abl的a2或a3的引物進行擴增，擴增產物在瓊脂糖或聚內烯酰胺凝膠電泳中出現特異的條帶，在典型的CML病例中，b3a2和b2a2擴增產物條帶相差75bp。常規RT-PCR的靈敏度為10-3～10-6。巢式PCR（Nested PCR）通過對第一輪的擴增產物進一步擴增，產生片段更短的PCR產物，敏感度提高到10-5～10-7。定性PCR技術己經普遍用于造血干細胞移植后MRD檢測。但定性PCR中不可避免地存在著假陽性或假陰性，所以，有必要應用定量PCR的方法對移植后患者進行微小殘留病變的動態監測。

1.3 實時定量PCR

所謂RQ- PCR技術是在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。目前國內外已發展了數種 RQ-PCR 技術，其中 TaqMan 法簡單易行、特異性好、假陽性低、線性關系好，整個過程采用全封閉反應管及光電傳導系統，無須顧及污染，亦無須對樣品進行稀釋和電泳，已被應用于病原體測定、腫瘤基因檢測、基因表達、突變和多態性研究等多個領域[6]。其工作原理是利用Taq 酶的5′→3′核酸外切酶活性。在PCR 反應系統中加入一個熒光標記探針，該探針的5′端和3′端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光團。當探針保持完整時，淬滅基團抑制熒光基團的熒光發射。熒光基團一旦與淬滅基團發生分離，抑制作用被解除，熒光基團被熒光探測系統檢測到。上述方法利用熒光產生原理，在PCR 過程中可以連續不斷地檢測反應體系中熒光信號的變化。所以RQ-PCR實現了從定性到定量的飛躍，其優點分別為：①靈敏度高，可達10-5，能區分轉錄本2～3倍變化[7]。②可靠、可重復：利用管家基

因可以對結果標準化，結果的可重復性好、可靠。③操作簡便、快速、污染小、安全：可以通過外周血標本檢測，減少了骨髓穿刺創傷且可以處理批量標本。整個PCR和檢測過程由電腦控制，完整的RQ-PCR分析耗時不超過60分鐘。擴增產物及產物分析在同一個反應體系中完成，不需PCR后處理，杜絕了擴增產物污染造成的假陽性。④定量監測：可以動態觀察轉錄水平的變化，對疾病狀態進一步分層，有利于早期療效分析和指導個體化治療。因此可作為CML治療后監測MRD的有效手段。

2RQ-PCR檢測bcr/abl融合基因的臨床意義

2.1 CML臨床分型與分期

依據Ph染色體和bcr/abl融合基因，90%以上慢粒同時表現為Ph陽性和bcr/abl陽性，在Ph陰性患者中，又有5%左右患者 bcr/abl陽性，稱為Ph陰性和bcr/abl陽性慢粒，其臨床表現、治療反應及預后與Ph和bcr/abl雙陽性慢粒相同。結合臨床表現、外周血象、骨髓形態、骨髓病理、染色體、融合基因等檢查，慢粒分為慢性期（CP）、加速期（AP）、急變期（BP）。

2.2 監測分子靶向治療療效

近十年來，隨著以伊馬替尼（IM）為代表的分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑在CML治療中的應用，使干擾素及異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）在成人中的傳統地位受到了挑戰。IRIS研究是迄今為止最大宗報道IM一線治療CML-CP患者的研究，IRIS 5 年的隨訪結果表明 OS、EFS 分別為89%、83%[8]，隨訪6 年 OS 及 EFS 分別為 88%、83%[9]，隨訪8 年 OS 及 EFS 分別為 85%、81%[10]。IRIS 試驗 7 年的隨訪結果顯示，治療 12 個月時 bcr-abl 轉錄本水平仍>1%較<1%預后差，治療 18 個月獲得與未獲得 MMR 的患者 EFS 分別為 98% vs. 89% （ratio< 0.1%， P= 0.01）[11]。Palandri等[12]的研究水平顯示達穩定 MMR、不穩定 MMR（達 MMR 又失去）及從未達 MMR 的患者的在 6 年的中位隨訪時間內失去 CCyR 的可能分別為 4%、21%及 33%。提示早期 bcr/abl轉錄本水平下降，且維持穩定水平的患者預后較好。轉錄本水平升高，表明 IM 耐藥疾病復發，連續多次監測到bcr/abl轉錄本水平連續升高對繼發耐藥的提示意義更大[13]。此時，應盡早轉換二代TKI 藥物。轉用二線藥物的患者，如果用藥后 3 個月內未取得次佳細胞遺傳學緩解，或未取得bcr/abl 轉錄本水平小于 10%，或者用藥后 12 個月內未取得主要細胞遺傳學反應（MCyR 和 CCyR），則預后不佳，需要考慮移植等其他治療方式[14]。

雖然IM治療CML-CP患者取得了卓著的療效，但仍有一些尚未解決的問題：①不能停藥；②耐藥的存在；③更長期的療效尚待觀察。故依據我國的國情，中國CML實踐推薦針對不同患者，給予TKI、HSCT、干擾素及細胞毒藥物結合的個體化治療[15]。

2.4 監測異基因造血干細胞移植療效

目前異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）仍是治愈CML的唯一手段，但移植也有可能不能完全清除異常克隆，成為白血病復發的根源。慢性期接受移植的CML患者中，約10%～20%復發，而在加速期或急變期接受移植的患者復發率超過50%。移植后復發是移植失敗的主要原因之一，移植后動態監測bcr/abl可以預測疾病復發。北京大學血液病研究所同胞全相合患者HSCT后3年OS 89.4%，復發率2.45%。分析93例單倍體移植治療CML的情況，顯示加速期患者4年DFS達66.5%，急變期4年DFS為53.8%[15]。這一臨床效果可能與以復發危險度評估和RQ-PCR連續監測MRD為基礎的復發分層預防體系最大限度的降低了復發風險有關[16]。許蘭平等[17]認為具有以下特點的為HSCT后復發低危患者：①移植術后+1個月較移植前下降至少2個對數級以上；②+2至+3個月持續下降或在低水平保持穩定；③+4至+6個月降低至測不出的水平的。此類患者無需給予干預治療，因此，通過應用實時定量PCR動態檢測CML患者HSCT后bcr/abl水平有助于篩選出無須進行復發干預的患者，可使復發干預更具針對性，從而提高HSCT總體生存率。國內外許多學者認為標準的allo-HSCT后3～5個月實時定量PCR的結果可以預測復發[18]。推薦的分子生物學復發標準為：A：在超過一個月間隔的連續三次定量PCR檢測中bcr-abl/abl>0.02%；或 B：連續兩次檢測bcr-abl/abl>0.05%；或 C：bcr-abl/abl 比值在連續 3 次檢測中上升，并且在后兩次檢測中比>0.002% [19]。Olavarria 等[20]用定量 RQ-PCR 研究 138 例 CML 患者 Allo-SCT 后早期的 bcr-abl mRNA 水平，并據此把患者分為陰性（未檢出）、低水平陽性（bcr-abl 轉錄本少于 100/μg RNA 或 bcr-abl/abl 小于 0.02%）和高水平陽性（轉錄本水平超過前述標準）三組。結果移植后 3 年這三組的累積復發率分別為 16.7%、42.9%和 86.4%（p=0.0001），而且轉錄本水平與復發可能性之間的關系不受供者類別、T細胞去除與否的影響。Elmaagacli 等[21]應用RQ-PCR對65例CML患者移植后的bcr-abl mRNA進行檢測，結果發現，經過中位標準化以后，bcr-abl mRNA 水平在不同病期有顯著性差異；其中，bcr-abl mRNA 水平在 17 例分子學復發為 0.004%；7 例細胞細胞遺傳學復發為 0.04%；36 例一直處于穩定期為 2.6%；5 例血液學復發為 36%。同時認為，RQ-PCR 法能對移植后早期復發進行檢測，能對分子學復發與細胞遺傳學復發進行鑒別（p<0.001 ），并進行早期干預治療，如：供者淋巴細胞輸注（DLI）、停止使用免疫抑制劑、使用干擾素等，可重新獲得分子學緩解。許蘭平等[22]分析64例行造血干細胞移植的CML患者，根據bcr-abl監測結果，在移植后早期進行了干預治療，方案為免疫調節、伊馬替尼單獨及與免疫調節聯合。結果伊馬替尼治療組、免疫調節治療組、聯合治療組患者bcr-abl融合基因轉陰率分別為86.0%、90.O%和83.9%（p=0.126）；4年累計白血病血液學復發率分別為32.3%、0和16.1%（p=0.130），單獨應用伊馬替尼組比免疫調節治療組復發率有增高的趨勢（P=0.052）；三組患者4年存活率分別為90.O%、89.7和83.O%（P=0.696）。三種治療方案可以達到相似的療效，但不良反應不同，應權衡并進行個性化選擇。

3結語

實時定量PCR是一種快速、準確、敏感和可靠的實驗方法。使用RQ-PCR的方法能定量動態觀察CML患者bcr/abl基因的轉錄水平變化，明顯優于RT-PCR等定性的檢查手段。應用RQ-PCR方法對CML異基因造血干細胞移植后微小殘留病進行監測，能在分子生物學水平上比細胞遺傳學更早地預測疾病的復發，使得在白血病負荷尚低時進行干預治療，并且能評價干預的療效，對疾病獲得良好的結果有重要的臨床意義。

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