HPLC法測定不同產地女貞葉中熊果酸的含量

王麗　閆春生　賈安　信建豪 黃濤

摘要

[目的]用高效液相色譜法（HPLC）考察5個不同產地女貞葉中熊果酸的含量。[方法]用高效液相色譜法所用色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測波長為210 nm。[結果]方法學考察結果，回歸方程為Y=4.715 5X+17.918，R2=0.999 4，熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml濃度范圍內線性關系良好。用該方法測得5個不同產地女貞葉中熊果酸的含量存在差異，其中上海市產的含量最高，為2.157 4 mg/g，南陽唐河產的含量最低，為0.863 0 mg/g。[結論]同一采集時間，不同產地的女貞葉因環境因素，所含熊果酸的含量差異較大。

關鍵詞女貞葉；熊果酸；HPLC；含量測定

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）28-09738-02

Determination of the Content of Ursolic Acid in Folium Ligustrum lucidus from Different Habitats by HPLC

WANG Li， YAN Chunsheng， JIA An et al（Huanghe Science and Technology College， Zhengzhou， Henan 450006）

Key words[Objective] The content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats was investigated by HPLC. [Method] Chromatographic column is eighteen alkyl silane bonded silica gel column chromatography （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， the mobile phase is acetonitrilemethanol-0.5% ammonium acetate （67∶12∶21）， the detection wavelength is 210 nm. [Result] Methodological study results： the regression equation： Y=4.715 5X+17.918， R2=0.999 4， the content of ursolic acid in 5.21-125.12 μg/ml， the concentration of the linear relationship is good. The content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats existis differences， the highest content of Shanghai produced is up to 2.157 4 mg/g， the lowest content produced in Nanyang Tanghe is 0.863 0 mg/g. [Conclusion] At the same acquisition time， the content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats has significant differences because of environmental factors.

Key wordsLigustrum lucidus； Ursolic acid； HPLC； Content determination

女貞葉為木犀科植物女貞Ligustrum lucidus Ait.的葉[1]，又名冬青葉、土金剛葉、爆竹葉[2]。 民間常用鮮女貞葉咀嚼慢咽的方法治療口腔潰瘍[3-4]。《中藥大辭典》載有女貞葉性平、味微苦、無毒，具有祛風、明目、消炎消腫、祛瘀散結、生肌止痛及收斂防腐之功效。在民間應用很廣，主要用于滋陰止血[5-6]。但目前，關于女貞葉沒有相關的質量標準，為了更好地開發應用，筆者特對其主要有效成分之一熊果酸的測定方法進行考察，并選取5個不同產地的女貞葉，對其熊果酸的含量進行比較，為女貞葉質量標準的制定提供依據。

1材料與方法

1.1材料

樣品采自鄭州市、上海市、新鄉市、南陽唐河縣、焦作武陟縣5個不同地區，分別編號20130801、20130802、20130803、20130804、20130805。經藥學教研室李勉教授鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidus Ait.的葉。8月底采摘，清洗干凈，陰干，粉碎，過50目篩，備用。以鄭州市采集的女貞葉（編號20130801）為主要對象進行研究。

1.2試劑

乙醇、乙酸銨（試劑均產自天津市分船化學試劑科技有限公司）為分析純；乙腈、甲醇為色譜純；熊果酸對照品（批號為110742—200313，供含量測定用）由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3試驗儀器

Agilent 1200 LC 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，生命科學與化學分析儀器部）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲儀KQ5200M（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；微孔濾膜（0.45 μm）水膜和有機膜。

1.4試驗方法

1.4.1

色譜條件。色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測波長為210 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μl。

1.4.2

對照品溶液制備和標準曲線繪制。

精密稱取熊果酸10 mg，加75%乙醇制成濃度為0.25 mg/ml的對照品溶液，搖勻，即可。精密量取儲備液相應量，然后用75%乙醇依次稀釋對照品溶液，其濃度分別為 5.21、10.42、20.82、41.64、93.28、125.12 μg/ml，分別進樣20 μl，記錄測定峰面積，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.3

供試品溶液制備。

取樣品粉末各1 g，精密稱定置10 ml具塞錐形瓶中，加入75%乙醇10 ml，超聲提取30 min置于室溫中放冷后，加入75%乙醇定容，搖勻，濾過取續濾液，以0.45 μm微孔濾膜濾過后作為供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 對照品與樣品的高效液相色譜峰圖

從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在對照品相同的出峰時間（t=12.9 min）也有一個峰出現，說明該峰即為樣品中熊果酸的峰，且該條件下樣品中熊果酸的峰與相鄰峰的分離度較大，說明此條件適合該樣品測定熊果酸。

2.2 對照品溶液制備和標準曲線繪制

以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，由圖2可見，其回歸方程為Y=4.715 5X+17.918（R2=0.999 4），表明熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml濃度范圍內線性關系良好。

2.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液分別在0、1、2、4、8 h進樣20 μl，測定峰面積并計算RSD值。結果發現，在0、1、2、4、8 h進樣測得同一樣品中酸果酸的峰面積分別為1 832.40、1 814.60、1 640.00、1 638.20、1 765.98，其RSD為4.8%，表明該樣品中熊果酸在8 h內是穩定的。

圖1 對照品（a）和樣品（b）熊果酸的HPLC圖譜

圖2 對照品溶液標準曲線

2.4 精密度試驗

通過取對照品溶液（熊果酸0.25 mg/ml）重復進樣5次，每次進樣20 μl，測定對照品的峰面積分別為2 197.43、2 098.64、2 057.08、2 106.09、2 027.22，其RSD值為2.7%，表明所用儀器精密度良好。

2.5 加樣回收率試驗

精密稱定已測知熊果酸含量的女貞葉供試品6份，分別精密加入熊果酸0.7 mg，按照“1.4.3”項方法進行提取和含量測定。結果發現（表1），熊果酸的平均加樣回收率為95.01%，RSD為0.2%。符合相關要求。

2.6 樣品含量測定

精密稱定5個產地的女貞葉樣品各3份，按照“1.4.3”項下樣品處理，得供試液，20 μl注入高效液相色譜儀，測定峰面積，用外標法計算供試品中熊果酸的含量。由表2可見，不同產地，女貞葉中熊果酸的含量差異較

大。其中上海市產的女貞葉中熊果酸含量最高，為2.157 4

mg/g；其次是新鄉市產的女貞葉，含量為2.027 3 mg/g；鄭州市產的女貞葉含量為1.570 7 mg/g；焦作武陟縣產的女貞葉含量是1.067 mg/g；南陽唐河縣產的女貞葉中熊果酸含量最低，為0.863 0 mg/g。

3 結論

（1）通過對HPLC法的方法學進行考察，結果得到回歸方程為Y=4.715 5X+17.918（R2=0.999 4），熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml濃度范圍內線性關系良好；且樣品穩定，儀器精密度和樣品的加樣回收率均達到了相關要求，說明該方法靈敏、可靠、準確。

（2）通過對選取的5個不同產地的女貞葉中熊果酸的含量進行分析計算，結果發現女貞葉中熊果酸的含量差異較大。其中，上海市產的女貞葉中熊果酸含量最高，為2.157 4 mg/g，南陽唐河縣產的女貞葉中熊果酸含量最低，為0.863 0 mg/g，說明不同產地因溫度、水分、土壤等不同，藥材中的化學成分的含量存在差異。這也為女貞葉質量標準的制定提供依據。

參考文獻

[1]

國家藥典委員會.中華人民共和國藥典，一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：43.

[2] 胡同瑜.實用中藥品種鑒別[M].北京：人民軍醫出版社，2012：545.

[3] 田鳳鳴，張咸遠.中國奇方全書[M].北京：科技出版社，2011：1266.

[4] 史書達.中國民間秘驗偏方大成[M].3版.蘇峰：內蒙古科學技術出版社，2012：1022.

[5] 徐謹，羅玲英，吳鐵容.二至丸的臨床應用與劑量關系研究[J].亞太傳統醫藥，2011，7（1）：131-136.

[6] 王長春，王永春，劉珊.淺談女貞子藥性特點與配伍運用[J].山東中醫藥大學學報，2013，37（3）：188-189.