均勻設計在柑橘砧木離體培養再生體系建立中的應用

郭雁君等

摘要[目的]建立枳殼離體培養再生體系。[方法]采用均勻設計研究了不同時期枳殼莖尖、 莖段、芽的愈傷組織誘導、增殖、分化、及生根情況。[結果]愈傷組織誘導率及生長量由高到低為春梢> 夏梢>秋梢>冬梢；不同時期外植體誘導愈傷組織所需生長調節物質種類、濃度、配比不同，佳。[結論] 為枳殼快速繁殖、脫毒技術和相關細胞工程的研究奠定基礎。

關鍵詞枳殼；離體培養；均勻設計

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）21-06934-03

Study on the Establishment of Regeneration System of Poncirus trifoliate（L.） Raf by Uniform Design

GUO Yanjun， JI Qianhua et al（Department of Biology， Fruit Tree Research Institute， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061）

Abstract[Objective] The aim was to study the establishment of regeneration system of Poncirus trifoliate（L.） Raf.[ Method]A regeneration method via callus was established in which uniform design was employed in the experimentation. Induction rate and quantity of callus were influenced by the types of explants. [Result]Callus were induced satisfactorily with spring shoots cultured in MT medium supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2.4D 0.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L and summer shoots in MT mediuin supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2，4D 4.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L. The calluses underwent good proliferation in MT medium supplied 6BA 0.25 mg/L and NAA 0.2 mg/L. MT medium with 6BA 0.25 mg/L and IBA 0.3 mg/L was favourable for redifferentiation and 1/2MT medium with NAA 4 mg/L resulted in the formation of strong roots.[Conclusion] The study laid foundation for rapid seedling breeding， detoxification technology.

Key words Tissue culture； Uniform design； Poncirus trifoliate（L.） Raf

基金項目肇慶學院柑橘產業技術應用與創新團隊建設項目；肇慶市科技計劃項目（2012N001）；肇慶學院協調創新基地建設項目（201401）。

作者簡介郭雁君（1973-），男，山西左云人，講師，碩士，從事遺傳育種研究。通訊作者，教授，博士，從事果樹學研究。

收稿日期20140423枳殼（Poncirus trifoliata（L.） Raf） 為蕓香科植物，其幼果及近成熟果實入藥，具有行氣、散結、消痰、除痞的功效。枳殼是柑橘中很好的砧木，能使樹體前期矮化，早結、豐產、優質，且抗腳腐病、流膠病和抗線蟲。枳殼也是廣東省肇慶地區主栽柑橘品種砂糖橘和貢柑的首選砧木品種。枳殼通過實生播種繁育，具有繁殖率低、出苗不整齊和受季節限制等缺點。利用組織培養進行快速繁殖可克服常規方法的缺點，且在無病毒苗木繁育技術體系中，同樣需要利用枳殼的無菌苗作為莖尖微嫁接的砧木材料。枳殼組織培養研究工作主要是砧木實生苗的快繁技術，通過對莖尖、剝去種皮的種子、花藥和枳根分生組織等的離體培養，得到再生植株；對枳胚珠、上胚軸等外植體進行培養，誘導出胚狀體和愈傷組織[1-4]。筆者運用均勻設計[5]，探討了在離體培養條件下不同取材時期、不同取材部位枳殼外植體的愈傷組織誘導、增殖、分化及生根情況，旨在建立枳殼離體培養再生體系，為枳殼快速繁殖、脫毒技術和相關細胞工程的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料 供試材料為枳殼6年生實生樹的春梢（莖尖、莖段）、夏梢（莖尖、莖段）、秋梢（莖尖、莖段）和冬梢上含芽莖段。

1.2試驗方法

2.2愈傷組織的繼代培養和增殖

3結論與討論

研究表明，用枳殼花藥、離體胚珠等作外殖體，可以誘導產生愈傷組織[1]，該研究采用枳殼春梢、夏梢和秋梢的莖尖、莖段以及冬梢帶芽的莖段為外植體，同樣誘導產生愈傷組織。多數植物組織（器官） 皆可在人工控制的條件下誘導產生愈傷組織，但不同取材部位對誘導愈傷組織的適應性不同，同樣影響愈傷組織的器官發生能力。該研究結果表明，枳殼春梢、夏梢莖段易產生愈傷組織，其中產生的致密、綠色、 瘤狀愈傷組織的器官發生能力較強，同時因取材受季節性影響小，取材容易，數量大等優點，在誘導愈傷組織的應用中較之花藥、胚珠等外植體材料具有廣泛的實用價值，且可以利用器官發生能力強的愈傷組織進行再分化研究。

愈傷組織的誘導、增殖主要受外植體、培養基和培養環境三大因素的調控，培養基種類和成分的研究以生長調節物質研究的最多，誘導和保持愈傷組織生長所需生長調節物質的種類、濃度及比例與外植體本身的生理狀態及對生長調節物質的敏感性有密切的關系[6]，這在該試驗中得到充分的驗證。

愈傷組織的不定芽及不定根的發生是植株再生的重要途徑。 愈傷組織類型、 培養基成分均對不定芽的發生有影響。該研究結果表明，枳殼愈傷組織中以致密、綠色、瘤狀愈傷組織的分化能力強。通過最優分析獲得了分化培養生長調節因子的最優配方。 一般細胞分裂素在愈傷組織分化培養中起重要作用，而生長素的作用則隨植物材料的不同而不同， 通常在一些植物中細胞分裂素與生長素的適當比例有利于不定芽的產生。

芽的分化具有更明顯的促進作用。

同大多數植物相似，在枳殼上生長素的作用在不定根的發生中也起關鍵性作用， 基本培養基中無機鹽濃度的降低有利于生根。研究表明，在不含激素的培養基上枳殼無根苗即可形成不定根[7]， 該試驗結果與其相反，在無激素的MT或1/2MT培養基上， 枳殼無菌苗愈傷化，而在1/2MT+4 mg/L NAA培養基上產生的不定根短而粗壯。陳力耕[7]在添加10-5 mol/L NAA培養基上經過15～20 d即發根成苗。但該試驗中枳殼組織培養物的生根仍存在問題，不定根的發生需經過一次繼代培養后，才能達2～3 cm長，生根較慢，生根培養的條件仍需進一步的摸索。

均勻設計在五味子、柴胡、西瓜等的組織培養中已有應用[8-10]，但在柑橘以及砧木上較少，該試驗運用均勻設計方法考慮了多種生長調節物質對枳殼愈傷組織誘導、增殖、分化的作用，并通過回歸分析給出了定量方程，通過最優分析預測了優化配方。均勻設計的特點是試驗點在試驗范圍內充分“均勻分散”，每個因素每個水平只進行一次試驗且試驗次數與水平數相等，可以以較少的試驗次數研究多因素多水平的問題。以4因素6水平為例，正交設計要72次試驗而均勻設計僅需6次試驗，大大減少了試驗次數，提高了工作效率，降低了試驗成本。在組織培養研究中，特別是生長調節物質作用的研究中，需要研究的生長調節物質種類和水平往往較多，降低試驗的復雜性對組培研究具有實際意義。該試驗通過6因素10水平較全面地考察了各因素對愈傷組織誘導作用的顯著程度，因水平設置多且范圍較寬， 能較準確、較容易地確定生長調節劑的作用水平范圍，而避免了多次試驗，取得了較好的效果。

參考文獻

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