巴西橡膠樹HbCZF1的原核表達分析

易紅艷等

摘 要 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）是天然橡膠生物合成途徑中的關鍵酶之一，在先前的研究中本課題組已克隆了與Hmgr1啟動子互作的轉錄因子基因HbCZF1。本研究在此基礎上，構建了HbCZF1的原核表達載體PET-28a（+）-HbCZF1，將其轉化E. coli Rosetta（DE3）菌株。經優化條件后，在20 ℃，0.1 mmol/L IPTG誘導4 h的條件下，獲得了分子量約47 ku的HbCZF1融合蛋白。

關鍵詞 巴西橡膠樹；HbCZF1基因；原核表達；蛋白純化

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract The enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase（HMGR）is involved in the biosynthesis of rubber. We cloned HbCZF1 which is interaction with the HbHMGR promoter in Hevea brasilensis. In order to study the function of HbCZF1， an HbCZF1 prokaryotic expression vector was successfully constructed. The pET-28a（+）-HbCZF1 construction was transferred into E. coli Rosetta（DE3）. Recombinant protein was expressed in abundance in E. coli Rosetta（DE3）after being induced by 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours at 20 ℃. The molecular mass of the recombinant protein is about 47 ku. The result laid a foundation for the further preparation of the HbCZF1 transcription factor antibodies and the analysis of interactions between the HbCZF1 and the HbHMGR promoter.

Key words Hevea brasiliensis； HbCZF1； Prokaryotic expression； Protein purification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.014

鋅指蛋白是真核生物基因組中廣泛存在的一類轉錄因子，在基因的表達調控、細胞分化、胚胎發育、成熟等生命過程中發揮重要作用[1-3]。在鋅指蛋白家族中，CCCH型鋅指蛋白僅占所有鋅指蛋白的約0.8%[4-5]。目前的研究結果表明：CCCH型鋅指蛋白在植物中的主要作用是調節植物生長發育以及生物和非生物的脅迫反應[6-10]，如Sun等[11]發現擬南芥AtSZF1和AtSZF2可負調控鹽脅迫相關基因的表達，Kong等[12]發現在水稻中過量表達CCCH型鋅指蛋白基因OsDOS可以延緩水稻葉片的衰老等。

巴西橡膠樹是一種重要的熱帶產膠植物，是天然橡膠主要的商業來源，在世界經濟發展中一直占有重要的地位。天然橡膠在橡膠樹的乳管內合成，以膠乳（乳管細胞的細胞質）的形式貯存[13]。橡膠生物合成是一種典型的植物甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）代謝途徑[13]。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）在MVA代謝途徑中不可逆地催化HMG-CoA形成甲羥戊酸，繼而合成橡膠前體物質，是MVA途徑的第1個限制酶， 也是天然橡膠生物合成途徑中的關鍵酶之一[13-20]。橡膠樹HMGR是由3個基因Hmgr1、Hmgr2和Hmgr3組成的基因家族編碼的。根據3個基因在組織中的表達特性，Chye等[21-22]認為Hmgr1可能與橡膠生物合成有關。張福城等[23]克隆了Hmgr1基因的啟動子，并對順式作用元件進行了分析。劉陳[24]利用酵母單雜交篩選到調控Hmgr1的CCCH型鋅指蛋白類的轉錄因子HbCZF1，但Hmgr1與轉錄因子HbCZF1之間的調控關系還不清楚。為了進一步研究Hmgr1與轉錄因子HbCZF1之間調控關系，本研究構建了HbCZF1原核表達載體并進行原核表達，獲得了HbCZF1的融合蛋白，為下一步制備抗體、凝膠遷移（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等深入研究Hmgr1與轉錄因子HbCZF1之間的調控關系打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

含有HbCZF1基因的質粒、原核表達載體pET-28a（+）、E. coli DH10B 菌株、E. coli Rosetta （DE3）菌株由本實驗室保存；Adevantage 2 PCR Kit 為Clontech公司的產品；pMD19-T Simple Vector試劑盒、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司的產品；普通質粒小提試劑盒、DNA marker、過硫酸銨、異丙基-β，D-硫代半乳糖苷（IPTG）、抗生素等均為中科瑞泰提供；Ni-NTA親和層析純化柱購于MACHEREY-NAGEL；各限制性內切酶、Protein marker為Fermentas公司的產品；HIS Tag羊抗兔抗體、二抗及Western-blot試劑盒為博士德公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據本實驗室現有的HbCZF1基因的ORF序列設計引物6PCZF1F/ 6PCZF1R，并在引物兩端加上酶切位點BamHⅠ/XhoⅠ（酶切位點下劃線表示），其序列為：6PCZF1F（5′-ACGGATCCATGAATCCATTGACGCTGGT-3′）；6PCZF1R（5′-GACTCGAGTCATCTCTCTGATTTGCG

CC-3′），引物的合成由北京諾賽生物技術公司完成。

1.2.2 pET-28a（+）-HbCZF1重組表達載體的構建

以橡膠樹HbCZF1基因的全長質粒為模板進行PCR擴增，反應條件為：首先在95 ℃ 2 min，然后在95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min進行30個循環。將擴增得到的目的片段純化后連接到 pMD19-T Simple Vector上，連接產物轉化感受態E. coli DH10B，在含Amp抗性的LB固體培養基上培養，挑取單菌落進行菌液PCR后，選取陽性克隆測序，并對測序正確的陽性克隆提取質粒進行BamHⅠ/XhoⅠ的雙酶切鑒定。將線性pET28a（+）載體片段和目的基因片段用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化感受態E. coli DH10B，篩選陽性克隆測序。選取測序正確的陽性克隆，提取質粒用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定。

1.2.3 HbCZF1基因的原核表達及表達條件的優化

將重組表達載體pET-28a（+）-HbCZF1和pET-28a（+）的空載體分別轉化E. coli Rosetta（DE3）菌株，挑取單菌落接種于5 mL Kan（100 mg/mL）抗性的LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養過夜，按1 ∶ 100的比例吸取菌液接種于20 mL Kan（100 mg/mL）抗性的LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養至OD600=0.5～0.8后，以1 mmol/L IPTG誘導4 h，取樣進行SDS-PAGE來觀察重組蛋白是否表達。然后分別以不同濃度的誘導劑IPTG（終濃度為0.1、0.3、0.5、1 mmol/L）和不同的誘導時間（1、2、3、4 h）進行誘導，將所取的樣品進行 SDS-PAGE分析。確定最佳的誘導時間和 IPTG濃度后，在20 ℃和37 ℃條件下分別進行誘導。在誘導結束后，4 ℃條件下離心收集菌體，每100 mL培養物的細胞沉淀重懸于4 mL含蛋白酶抑制劑PMSF的結合緩沖液（pH=7.8，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl）中，用超聲波破碎儀破碎菌體，離心后分別取上清和沉淀樣品進行SDS-PAGE分析，以確定最佳的誘導條件。

1.2.4 重組蛋白的純化及鑒定 收集菌體，每100 mL培養物的細胞沉淀重懸于4 mL含有蛋白酶抑制劑PMSF的結合緩沖液（pH=7.8）中，超聲波破碎至菌液澄清，離心后收集上清，將收集的上清過Ni-NTA層析柱并洗脫下來，即可得到純化的重組蛋白。該蛋白經SDS-PAGE電泳、轉膜后，用羊抗兔HIS標簽的抗體進行Western-blot鑒定。

2 結果與分析

2.1 HbCZF1原核表達載體的構建

根據本實驗設計的引物，以HbCZF1基因的全長質粒為模板，通過PCR進行擴增到1條特異性條帶（圖1），測序結果表明，該條帶大小為1 110 bp，且其序列與已知序列一致，并無錯配堿基的出現。

將純化的目的條帶克隆到pMD19-T Simple載體上，選取測序正確的陽性克隆的質粒，對其進行雙酶切鑒定，并將其命名為pMD19-T-HbCZF1。質粒pMD19-T-HbCZF1經限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，凝膠電泳分析可見2 500 bp左右大小的載體片段條帶與1 110 bp左右大小的目的片段（圖2）， 表明目的片段成功克隆到pMD19-T Simple載體上。

pMD19-T-HbCZF1重組質粒經BamHⅠ和XhoⅠ酶切后回收HbCZF1基因片段，與同樣經過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET-28a（+）連接，轉化篩選后得到重組質粒，并將其命名為pET-28a（+）-HbCZF1。同時，選取重組質粒的陽性克隆送去測序，測序結果與對應序列一致。用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對測序正確的重組表達質粒pET-28a（+）-HbCZF1進行雙酶切鑒定。重組質粒經雙酶切后可見約5 400 bp大小的載體片段與1 110 bp大小的目的基因片段（圖3），表明目的基因片段已經插入到pET-28a（+）表達載體中。

2.2 重組蛋白表達條件的優化

在37 ℃下，以1 mmol/L IPTG誘導4 h后，SDS-PAGE電泳結果表明：pET-28a（+）-HbCZF1樣品中有分子量47 ku左右的特異表達蛋白條帶，而pET-28a（+）的樣品則沒有（圖4-A），這與預測結果一致。在37 ℃下，以不同濃度的IPTG誘導4 h后，均有目的重組蛋白表達，幾個測試的IPTG濃度對表達的蛋白量影響無明顯差異（圖4-B），因此選取IPTG濃度為0.1 mmol/L進行下一步的研究。在37 ℃和IPTG濃度為0.1 mmol/L條件下，隨著誘導時間的增加，重組蛋白的表達量隨之增加（圖4-C）。誘導結束，超聲波破碎菌體處理后，沉淀中含有重組蛋白，上清中亦有不少重組蛋白的存在。這說明該重組蛋白有可溶性的表達。在相同誘導時間（4 h）內，0.1 mmol/L的IPTG誘導時上清中含有的重組蛋白最多（圖4-D）。因此，初步確定終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導4 h是重組蛋白適合的表達條件。

在確定了的最適IPTG濃度和表達時間條件下，對誘導的溫度進行比較。電泳結果表明：20 ℃和37 ℃的誘導條件下都有大量目的蛋白表達（圖5）。經超聲波破碎處理，誘導下20 ℃目的蛋白上清中的蛋白含量相較于37 ℃有微量的增加，但并不顯著（圖5）。即與37 ℃誘導條件相比，溫度降低后可溶性蛋白含量并沒有明顯增加，故用 20 ℃或37 ℃誘導均可。

2.3 重組蛋白的純化及鑒定

20 ℃，0.1 mmol/L IPTG誘導后，用Ni-NTA柱純化蛋白后SDS-PAGE檢測發現：純化所得的蛋白分子量亦約為47 ku（圖6-A），這與未純化的融合蛋白大小一致，可推測該純化的蛋白即為目的蛋白。Western-blot的檢測結果表明：該純化的蛋白帶有HIS標簽（圖6-B），即可知純化得到的目的蛋白就是HbCZF1蛋白，可用作抗原制備多克隆抗體或進行EMSA。

3 討論

目前對橡膠樹中HMGR的表達調控機制還不了解，為了深入研究HMGR的表達調控的分子機制，本研究室利用酵母單雜技術篩選調控HMGR的轉錄因子，并已獲得與Hmgr1啟動子互作的CCCH型轉錄因子HbCZF1。HbCZF1是橡膠樹中首個被發現的CCCH型鋅指蛋白，為了進一步研究HbCZF1的功能及其與Hmgr1啟動子的調控關系，筆者對HbCZF1進行了原核表達分析。

原核表達系統是目前掌握最為成熟的一種表達系統，通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白，其優點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物，且所需的成本相對比較低廉[25]。但同時原核表達系統還存在如通常使用的表達系統無法對表達時間及表達水平進行調控，有些基因的持續表達可能會對宿主細胞產生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難等缺點[26]。因此選擇原核表達系統必須對表達條件進行優化。在對HbCZF1進行原核表達時，曾構建了4種重組表達載體pET-28a（+）-HbCZF1、pGEX6P-1-HbCZF1分別轉入表達宿主菌E. coli Rosetta（DE3）中。結果發現pGEX6P-1-HbCZF1沒有獲得表達，究其原因還需探討。在優化pET-28a（+）-HbCZF1在E. coli Rosetta（DE3）菌株中的表達條件中，采用適當的IPTG濃度及誘導時間、溫度，盡量減少了過量表達對細胞的毒害作用，故得到了表達量較高的可溶性融合蛋白，并進一步獲得了純化的目的蛋白。HbCZF1的原核表達的研究為下一步制作單克隆抗體，利用EMSA等進一步研究轉錄因子HbCZF1的功能奠定了基礎。

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