巴西橡膠樹HbDRM的克隆與表達分析

汪晗等

摘 要 運用PCR和RACE技術從巴西橡膠樹中克隆出了一個域重排甲基轉移酶（Domains rearranged methyltransferase， DRM）基因（HbDRM）。HbDRM全長為2 245 bp，含有1 917 bp的閱讀框，145 bp的 5′-UTR和176 bp 3′-UTR，編碼638個氨基酸，分子量為71.39 ku，等電點為4.90。HbDRM的氨基酸序列與可可、葡萄、黃瓜、鷹嘴豆、番茄、擬南芥DRM家族成員的同源性分別為77%、74%、72%、67%、64%和52%。定量RT-PCR分析表明HbDRM在巴西橡膠樹的根、樹皮、葉、花、膠乳、胚和愈傷組織中均有表達，其中在花和愈傷組織中表達量較高，在膠乳中表達量最低，此外HbDRM在橡膠樹自根幼態無性系的膠乳中表達比其供體膠乳中的表達低。HbDRM的克隆和表達分析為下一步研究HbDRM在巴西橡膠樹自根幼態無性系高產中的作用打下基礎。

關鍵詞 巴西橡膠樹；域重排甲基轉移酶；DNA甲基化；自根幼態無性系；克隆與表達

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract The full-length cDNA encoding a domains rearranged methyltransferase， designated HbDRM，was isolated from rubber tree by using PCR and RACE techniques. HbDRM was 2 245 bp in length and contained an open reading frame of 1917 bp. Sequence analysis revealed that the ORF of HbDRM encoded 638 amino acid residues with apredicted molecular mass of 71.39 ku. The deduced amino acid sequences of HbDRM showed high identities of 77%， 74%， 72%， 67%， 64% and 52% to those of the DRM from Theobroma cacao， Cucumis sativus， Cicer arietinum， Solanum lycopersicum and Arabidopsis thaliana. HbDRM expressed at different levels with the highest transcription in the flowers， followed by the callus and leaves. HbDRM transcript expressed at different levels with the lower in self-rooting juvenile clones than in their donor clones. The present study perhaps contributes towards an understanding of the molecular mechanism underlying high yielding in self-rooting juvenile clones.

Key words Hevea brasiliensis；Domains rearranged methyltransferase；DNA methylation；Self-rooting juvenile；Cloning and expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.016

表觀遺傳是指不因DNA序列的變化而形成的基因功能的改變，這種改變又可隨細胞的有絲分裂和/或減數分裂遺傳下去的現象[1]。表觀遺傳的分子機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質改型和小RNA干擾等。甲基化是一種主要表觀遺傳修飾形式，是調節基因功能的重要手段[2]。通過一系列DNA甲基轉移酶來建立和維持DNA甲基化模式[3]。在植物DNA的甲基化過程中，目前發現至少有3類在結構和功能上不同的胞嘧啶甲基轉移酶[3-5]：第1類是MET1（Methyltransferase， MET），甲基轉移酶家族，其主要功能是作為維持DNA的甲基化，也可能在DNA重新甲基化中起作用[6-7]；第2類是染色質甲基化酶（Chromomethylase， CMT），是植物特有的一種甲基化酶，可以選擇性的對異染色質區域DNA甲基化[8]；第3類則是域重排甲基轉移酶（Domains Rearranged Methyltransferase， DRM），與哺乳動物的從頭甲基轉移酶（de novo methyltransferase 3， DNMT3）相似，主要參與RNA指導的DNA甲基化[9-11]。

天然橡膠是一種重要的工業原料，巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）作為一種重要的產膠植物，是天然橡膠主要的商業來源，是熱帶地區重要的經濟作物。巴西橡膠樹自根幼態無性系是以橡膠樹花藥為外植體經過組織培養得到的再生植株[12-13]。大量的對比實驗表明同一品系的自根幼態無性系橡膠樹的產量比相應的供體（老態無性系）可提高20%～50%[13-16]，但對橡膠樹自根幼態無性系高產的機制方面的研究目前還很少，歸納起來自根幼態無性系高產的構成因子主要有：較快的生長速度、較多的乳管列數目、較好的排膠和產膠生理特性[14]。Yuan等[17]對第5割年自根幼態無性系及其供體樹樹皮結構和生物特性進行研究，發現幼態無性系的莖圍增大、乳管層數增多、干膠含量提高、堵塞指數和黃色體破裂指數變低、膠乳糖和無機磷含量提高。王澤云等[18]認為自根幼態無性系的膠乳再生能力和排膠性能均顯著優于老態無性系是高產的生理基礎，而這種差異的實質是相關基因表達在時空和強度上的差異。李輝亮[19]證實了橡膠樹自根幼態無性系與老態無性系基因組DNA之間存在甲基化多態性的差異，此外發現在自根幼態無性系和老態無性系的膠乳中存在基因和蛋白的差異表達[20-25]，但造成差異的根本原因還不清楚。橡膠樹自根幼態無性系與供體的遺傳背景沒有差異，也就是說所含遺傳物質DNA在堿基序列上應該是相同的，因此自根幼態無性系與其供體之間所表現出的差異，很可能與表觀遺傳修飾中的DNA甲基化相關。

為了研究橡膠樹自根幼態無性系高產與DNA甲基化的關系，本課題組對橡膠樹的3類胞嘧啶甲基轉移酶基因進行了相關的研究。本研究將報道巴西橡膠樹DRM基因（HbDRM）的克隆和表達，該結果為進一步研究橡膠樹自根幼態無性系高產與DNA甲基化的關系打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗選用巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）海墾2號自根幼態無性系及其供體老態無性系，用于差異表的幼態無性系和老態無性系的膠乳采于同一時間，采自同一試驗田的生長狀態良好，樹齡相同的植株。膠乳的采樣按照參考文獻[26]進行，用液氮收集。葉片、花、根、樹皮、芽、胚和愈傷組織采集后用液氮研磨后最終于-70 ℃保存待用。

1.1.2 質粒、菌種及試劑 Taq DNA Polymerase購于Fermentas公司，T4-DNA連接酶、RNA PCR（AMV）Ver.3.0、5′和3′-full RACE Core Set購自TaKaRa公司。IPTG、X-gal、dNTPs購于Promega 公司。E.coli DH5α菌株由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 橡膠樹膠乳、葉片、花、根、樹、芽、胚和愈傷組織的RNA提取參照按照參考文獻[27]的方法進行。

1.2.2 HbDRM的5′和3′RACE擴增 用于5′和3′RACE擴增的cDNA的合成按5′和3′full RACE Core Set（TaKaRa 公司）試劑盒說明書進行。根據實驗室獲得的HbDRM片段序列設計5′和3′RACE引物用于5′和3′RACE擴增。引物分別為5P1：5′-C

CATCATAATCTGAAGACCAGTGATCAG-3′；5P2：5′-CCATTTTCCTGAATTGCTTCAGCAACC-3′。3P1：5′-TGCCGTAAATGGAATCTGGTATGGGTG-3′；3P2：5′-GCTTTTGGGTTTCCCTAGGAACCATAC-3′。5′和3′RACE擴增按照5′和3′-full RACE Core Set試劑盒說明書進行。

1.2.3 HbDRM閱讀框序列的PCR擴增 利用DNAMAN軟件對HbDRM片段、3′-RACE和5′-RACE獲得的片段拼接，根據拼接結果設計引物擴增HbDRM閱讀框序列。引物為F1：5′-ATGGATG

GAGATTCGTTTTGTG-3′；R1：5′-TCAATTTCTA GTCATTATACACT-3′。PCR反應體系，94 ℃預變性3 min后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 35 s，32個循環，再繼續延伸10 min。PCR產物的克隆按分子克隆實驗指南的方法進行，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成[27]。

1.2.4 HbDRM的同源性分析和進化樹構建 利用DNAMAN軟件分析HbDRM蛋白與其它植物的DRM家族同源性和進化樹構建。

1.2.5 HbDRM熒光定量分析 熒光定量采用SYBR Premix Ex TaqⅡ，以HbACT基因為內參對照。用于qPCR的引物 qF：5′-GGTGGGAGTCCAT

GCAATAATC-3′；qR：5′-CCAAGTCTAGAATGCG ACAGAAAT-3′。actinF：5′-CAGTGGTCGACAACTG

GTAT-3′；actinR：5′-ATCCTCCAATCCAGACACT GT-3′。反應條件為開始在95 ℃預變性 30 s然后按95 ℃ 5 s、 60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s 進行35個循環。基因的相對表達量按BIO-RAD CFX96熒光定量儀使用說明進行分析。

2 結果與分析

2.1 HbDRM的克隆

通過對其它植物中的DRM的同源比對分析，獲得了DRM家族保守結構域。根據保守結構域設計簡并引物通過PCR獲得了橡膠樹DRM基因的片段，根據該片段設計RACE引物，通過3′-RACE和5′-RACE技術分別得到一個1 161 bp的片段和一個919 bp的片段。利用DNAMAN軟件對橡膠樹DRM基因片段、3′-RACE和5′-RACE獲得的片段拼接，得到長2 245 bp的序列（命名為HbDRM）。該序列含有1 917 bp的閱讀框架，此外有145 bp的5′非編碼區和176 bp的3′非編碼區，在3′端非編碼區存在一個15個堿基的polyA尾（圖1）。根據拼接結果設計特異引物，對HbDRM的閱讀框架進行PCR擴增，測序結果與拼接結果完全一致，表明拼接結果正確。

2.2 HbDRM生物信息學分析

將推導的HbDRM蛋白序列進行BLASTp分析，發現HbDRM蛋白與可可（Theobroma cacao）、葡萄（Vitis vinifera）、黃瓜（Cucumis sativus）、鷹嘴豆（Cicer arie-tinum）、番茄（Solanum lycopersicum）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）等物種的DRM家族成員具有較高的同源性，分別為77%、74%、72%、67%、64%和52%（圖2）。進一步將HbDRM蛋白與其它植物的DRM家族成員進行進化樹分析，發現HbDRM與可可的DRM親緣關系最近（圖3）。

2.3 HbDRM的組織特異性表達

為分析HbDRM的組織表達特性，對HbDRM在橡膠樹的根、皮、花、葉、膠乳、胚和愈傷組織的表達進行了定量PCR分析。結果表明HbDRM在所測試的組織中均有表達，其中在花和愈傷組織中表達量相對較高，在膠乳中表達量最低（圖4）。

2.4 HbDRM在自根幼態無性系與其供體膠乳的差異表達

乳管是天然橡膠合成的場所，膠乳實質上是乳管細胞的細胞質。為了分析自根幼態無性系與其供體乳管細胞中HbDRM的表達是否存在差異，對HbDRM在自根幼態無性系與其供體膠乳的表達進行了定量PCR分析。結果表明HbDRM在自根幼態無性系的表達比其供體膠乳的表達低（圖5）。

3 討論

DRM基因已經從擬南芥、水稻和煙草等植物中克隆，并進行了相關分析[28-31]，但是到目前為止還未見橡膠樹DRM基因的研究報道。本研究首次克隆了橡膠樹中DRM基因HbDRM，對其編碼的氨基酸與其它植物的DRM的同源性和分子進化進行分析，推導HbDRM是一種與植物DNA甲基化相關的域重排甲基轉移酶。

DNA甲基化可調控特定的內源基因表達，而植物啟動子區的DNA甲基化通常抑制轉錄[1，4]。域重排甲基轉移酶DRM在RNA指導的DNA甲基化中起重要作用[9-11]。DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達，不同組織的基因是選擇性表達的，意味不同組織基因甲基化狀態是不同的。本研究發現HbDRM在不同組織中差異表達，表明不同組織中DNA甲基化水平存在差異。此外HbDRM在自根幼態無性系的表達比其供體膠乳的表達低，可能造成自根幼態無性系和供體乳管細胞中DNA甲基化的差異，使得自根幼態無性系和供體乳管細胞中基因的表達出現差異，這一結果進一步支持李輝亮[19]提出的DNA甲基化修飾是自根幼態無性系與其供體差異產生的重要原因的推斷。目前還不清楚HbDRM在巴西橡膠樹自根幼態無性系高產中的作用，HbDRM基因的克隆和表達分析為下一步研究HbDRM在巴西橡膠樹自根幼態無性系高產中的作用打下基礎。

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