柱花草種質遺傳多樣性的SSR和SRAP分析

尹曉暢等

摘 要 應用SSR和SRAP標記，對20份柱花草種質的遺傳多樣性進行研究。從113對SSR引物中篩選出41對多態性較好的引物，共擴增出229個位點，多態性比率達76.86%，平均每個引物擴增多態性位點4.29個。從224對SRAP引物中篩選出25對多態性較好的引物，共擴增出359個位點，平均每個引物擴增多態性10.72個，多態性比率達74.65%。綜合SSR和SRAP兩種標記對20份材料計算出的遺傳相似系數（GS）為0.65～0.90，表明柱花草種質遺傳多樣性比較豐富；通過UPGMA聚類分析，把這20份材料聚為3個類群，其中類群Ⅰ又分為4個亞類。

關鍵詞 柱花草；遺傳多樣性；SSR；SRAP

中圖分類號 S541.9 文獻標識碼 A

Abstract SSR and SRAP molecular markers were used to study genetic diversity among 20 Stylosanthes cultivars. 41 of 113 SSR and 25 of 224 SRAP pairs of primer were employed. 229 SSR and 359 SRAP markers were obtained respectively， with polymorphism 76.86% and 74.65%， respectively. The genetic similarity coefficients were 0.65～0.90. It indicated that Stylosanthes had an abundant genetic polymorphism in different cultivars. In addition， using UPGMA-clustering analysis， the materials could be divided into three groups， and groups I could be further divided into four sub-groups.

Key words Stylosanthes； Genetic diversity； SSR； SRAP

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.019

柱花草（Stylosanthes spp.）是熱帶、亞熱帶地區重要的豆科牧草和飼料植物資源，原產南美洲及加勒比海地區，中國于20世紀60年代開始引入[1]，經引種選育和誘變育種育出了熱研2號、熱研5號、熱研7號、熱研10號、熱研20號、熱研21號等9個柱花草品種并應用于生產，柱花草已成為我國熱區重要的替代蛋白質飼料資源和水土保持當家草種[2-3]。

培育優質、高產、抗逆性強的柱花草新品種，是目前我國柱花草育種的主要目標。分子標記方法能真實反映品種間的親緣關系，從而為雜交育種中親本的選配提供理論支持[4]。簡單序列重復標記（Simple Sequence Repeat， SSR）具有多態性高、檢測簡便、共顯性遺傳等特點[5]，是一種應用十分廣泛的分子標記方法；而相關序列擴增多態性（Sequence Related Amplified Polymorphism， SRAP）由美國加州大學Li與Quiros于2001年開發出來，作為近年來新開發的一種分子標記技術，具有操作簡便、多態性高、高效、在基因組上分布均勻等優點[6]。2種標記聯用進行遺傳多樣性分析的研究在國內外都有報道[7-9]。本研究應用SSR和SRAP分子標記技術，對中國熱帶農業科學院（CATAS）的部分選育柱花草品種、航空誘變柱花草新品系及國外引進的柱花草種質[10]進行了遺傳多樣性分析，從而為柱花草種質鑒定及育種實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試種質 實驗選用的20份柱花草品種（品系）由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供（表1）。這些柱花草種質為該所育成的航空誘變品種（7號和13號）、航空誘變品系（1號～6號、8號～12號）以及從國外引進優良種質（14號～20號）。

1.1.2 試劑和儀器 試驗所用EasyTaqR DNA Polymerase for PAGE，10×EasyTaqR Buffer for PAGE，2.5 mmol/L dNTPs，6×DNA Loading Buffer購自北京全式金生物技術有限公司。DSTM 2 000 Marker購自廣州東盛生物科技有限公司。PCR儀為Biometra TGradient，電泳系統為北京六一廠生產的DYY-6C和DYC-23。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取方法 取柱花草嫩葉，采用改良CTAB法[11]提取基因組總DNA。

1.2.2 PCR反應體系和擴增程序 SSR-PCR擴增總反應體系為20 μL，其中Taq Polymerase 0.3 μL﹑10×Taq Buffer 2 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL﹑10 μmol/L引物0.8 μL﹑50 ng/μL模板DNA 2.5 μL﹑用ddH2O補足體系；SSR-PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。SRAP-PCR擴增總反應體系為25 μL，其中Taq Polymerase 0.2 μL﹑10×Taq Buffer 2.5 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 2 μL﹑10 μmol/L引物0.75 μL﹑50 ng/μL模版DNA 0.5 μL﹑用ddH2O補足體系；SRAP-PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，5個循環；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。4 ℃保存。

1.2.3 引物的篩選 本實驗所用SSR引物通過NCBI公共數據庫查得，SRAP引物參照Li等[9]所選的引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。利用3個種質進行引物篩選，選出多態性好的引物再對20份材料進行PCR擴增。

1.2.4 結果檢測 PCR擴增產物用8% PAGE膠進行檢測，正式電泳前對已制好的PAGE膠預電泳30 min，之后加入3 μL反應產物點樣，250 V恒壓電泳3 h。電泳結束后銀染檢測。

1.3 數據分析

統計SSR和SRAP多態性條帶（有帶讀1，沒有帶讀0），用NTSYS-2.10e軟件計算材料間遺傳相似系數（GS），按非加權平均法（UPGMA）聚類分析構建樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 SSR和SRAP標記的多態性

從113對SSR引物中篩選出41對多態性較好引物組合對20個柱花草品種（品系）進行分析，共得到229個位點，多態性位點176個，多態性比率為76.86%，平均每個引物擴增多態性位點4.29個（表2）。從224對SRAP引物中篩選出25對多態性較好的組合進行分析，一共得到359個位點，多態性位點268個，多態性比率為74.65%，平均每個引物擴增多態性位點10.72個（表3）。SSR引物SG03G8（見圖1）和SRAP引物me9+em9的擴增結果見圖2。統計擴增片段大小在100～500 bp之間。

2.2 綜合2種標記的聚類分析

用NTSYS-2.10e軟件對20份材料基于SSR和SRAP標記上的遺傳相似系數（GS）進行計算，其GS值變換范圍在0.65～0.90之間，平均GS值為0.779 731。TPRC2001-15與TPRC2001-81遺傳相似系數最大為0.895 548，熱研21號和馬弓形柱花草遺傳相似系數最小為0.601 027。

用UPGMA法對SSR和SRAP所得的數據進行聚類分析（圖3）。在GS=0.79時，將材料分為3個群體。第Ⅰ群體包含17份種質，都為圭亞那柱花草。第Ⅱ群體只有Tardio柱花草1個品種，Tardio柱花草雖然是圭亞那種，但其表型與其他圭亞那柱花草有很大差異，尤其是其葉片表面有粘稠物質分泌，屬高抗病柱花草品系。第Ⅲ群體包含馬弓形柱花草和Oxley柱花草，田間表現都有莖的生長習性為斜倚型，植株矮小，葉片短小，產量較低的特點，兩者之間的遺傳系數為0.845 89，說明親緣關系較近。

在GS=0.83時，又可以將第Ⅰ群體分為A、B、C和D 4個亞類，A亞類包含TPRC2001-1、TPRC2001-5、TPRC2001-7、TPRC2001-9、TPRC2001-15、TPRC2001-79、TPRC2001-81；B亞類包含TPRC2001-55、TPRC2001-80、TPRC2001-84、TPRC2001-85、熱研20號柱花草，這12個品種（品系）為熱研2號柱花草太空誘變品系，其遺傳相似系數相近，說明太空誘變品系遺傳變異不大；C亞類包含Nina柱花草、Temprano柱花草、Stylo540（3008）、Stylo541（3009），這4個株系為澳大利亞引進品種，聚為一類說明其親緣關系較近；D亞類為熱研21號柱花草，是20份柱花草材料中唯一開白花的品種。

3 討論與結論

本試驗分別采用SSR和SRAP 2種分子標記技術對20份柱花草種質進行遺傳分析，結果顯示這2種標記均具有較高的多態性比率（分別為76.86%和74.65%）。但SSR多態性比率較蔣昌順等[12]報道的低，SRAP多態性比率也較張偉麗等[13]報道的低，這可能是由于他們所用的實驗材料種間差異較大遺傳背景較寬，而本實驗只有1份材料不是圭亞那種，且多是“熱研2號”柱花草航空誘變選出的品種或品系，遺傳背景較窄造成的，SSR引物選擇不同也是原因之一。

SSR標記是分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，主要集中在非編碼區，更多地反映了全基因組的遺傳豐富度[14]；而SRAP標記目標擴增區域是開放讀碼框，功能區域比基因組的其他區域更具保守性[15]。在進行譜系分析時，為了得到盡可能準確的親緣關系進化圖，用不同的分子標記綜合起來進行親緣關系的評價是非常必要的，綜合多種分子標記的分析可以有效減少各自方法產生的誤差[16]。本實驗綜合SSR和SRAP兩種標記所得的數據分析柱花草品種間的親緣關系，TPRC2001-15與TPRC2001-81遺傳相似系數最大為0.895 548，這兩個誘變品系的產量較高和開花期接近[17]。熱研21號（S. guianensis cv.Ryan no.21）和馬弓形柱花草（S.hippocampoides Fine stem stylo）遺傳相似系數最小（0.601 027），兩者屬于不同種，熱研21號柱花草莖的生長習性為直立型、開白花、產量高，而馬弓形柱花草為斜倚型植株、黃花、植株矮小。

通過聚類分析作圖將20份柱花草材料分為3類群。第Ⅰ群體A、B和D亞類中的13個株系為熱研2號柱花草太空誘變后代，其在產量、花期和抗病等方面差異明顯[17]。熱研21號柱花草單獨在D亞類，也是這20份種質中唯一開白花的柱花草，沒有和其他熱研2號柱花草誘變品系聚在一起可能是產生了較大變異，此聚類結果可以在分子水平上提供依據。

Tardio柱花草（S. guianensis Tardio）單獨聚為第Ⅱ類，Tardio柱花草具有葉片表面粘稠的顯著特點，且是20份種質中唯一來源于哥倫比亞，因此它跟其他圭亞那類柱花草的遺傳相似系數較低。

馬弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）和Oxley柱花草（S. guianensis cv. Oxley），雖然從種名來看應該分屬于不同種，但也存在著不同的觀點，如Orr D M等[18]認為馬弓形柱花草來源于Oxley柱花草，是Oxley柱花草的早花品種。本實驗分子標記聚類結果顯示兩者聚成第Ⅲ類（見圖3），且兩者田間表型相似，都具有莖的生長習性為斜倚型，葉片短小、植株矮小、早花等特點。但是否來源于同一個種，有待進一步研究。

綜上所述，應用SSR及SRAP標記聚類分析的結果表明了供試的柱花草材料的遺傳關系與其地理分布、生態類型、形態特征等具有一定的相關性。能夠有效分析柱花草種質的親緣關系和遺傳多樣性。綜合2種標記協同的方法，對柱花草基因的功能區域和全基因組有較好的檢測能力，對柱花草種質資源的鑒定、利用及其育種實踐等具有一定的參考價值。

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