22份余甘子核心種質資源遺傳多樣性的SRAP分析

郭林榕等

摘 要 利用SRAP標記檢測資源圃中保存的代表南方濕潤分布區（福建、廣東、廣西）的22份余甘子種質材料遺傳多樣性。結果表明：8對SRAP引物組合共產生167條擴增帶， 其中135條為多態性條帶。多態性條帶比率為68.8%～90.0%， 平均為80.8%。分析計算余甘子種質間的遺傳相似度（GS），22份材料GS的范圍為0.641～0.964。UPGMA法聚類分析結果表明，22份種質可分為兩大類，其中福建地區15份余甘子間的遺傳相似系數為0.641～0.964， 廣東地區5份余甘子的遺傳相似系數為0.707～0.952。此研究結果表明，余甘子基因型具有豐富的遺傳多樣性，SRAP技術可有效運用于余甘子資源的遺傳多樣性分析。

關鍵詞 余甘子；SRAP；種質；遺傳多樣性

中圖分類號 S667.9 文獻標識碼 A

Abstract Twenty-two Phyllanthus emblica germlasms collected from humid regions of Southern China（Fujian， Guangdong and Guangxi） were used to analyze their genetic diversity. 167 bands were amplified by 8 selected primer combinations， in which 135 bands were polymorphic. The percentage of polymorphic fragments was 68.8%-90.0%， and 80.8% in average. The genetic similarity coefficients were ranged from 0.641 to 0.964 among these germlasms. Using unweighted pair-group method with arithmetic means（UPGMA） cluster analysis on the SRAP markers， the germlasms could be divided into two groups. The genetic similarity coefficients were ranged from 0.641 to 0.964 from 15 Fujian germlasms， and 0.707-0.952 from 5 Guangdong germlasms. All results suggested that SRAP markers were suitable for the research of the genetic diversity on ryegrass.

Key words Phyllanthus emblica；SRAP；Germplasm；Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.022

余甘子（Phyllanthus emblica L.）為大戟科葉下珠屬植物，漢楊孚《異物志》中即有記載，為原產中國的珍稀果樹，是藥食同源的優良樹種[1-9]。因其抗性強、耐旱耐貧脊，對紅壤、黃壤、砂壤等多種土壤適應性較強，現主要分布于福建、云南、廣西、廣東、貴州、臺灣、海南、四川等熱區省份。中國擁有大面積的野生資源群落，野生種、農家種、栽培品種（系）栽培歷史約有2 000 a，時間長、分布廣，造成余甘子種質之間同名異物、同物異名現象的廣普性。只有闡明余甘子種質間基因的親緣關系，才能為種質的分類，遺傳育種和種質資源保存提供有力證據。福建省農科院果樹所依托省科技廳重點項目、國家科技基礎條件平臺項目，在2008年建立了國內首個余甘子種質資源圃，開展余甘子種質資源的鑒定、評價及資源的標準化整理、整合工作。研究中引入SRAP分子標記技術，分析收集、保存的余甘子種質資源，擬建立品種特異性的標準DNA指紋圖譜，進行遺傳多態性、系統發育與演化等方面的研究，為余甘子種質資源的準確鑒別及相互間親緣關系分析提供科了科學依據。

SRAP（Sequence Related Amplified Polymor phism）是2001年首先由美國加州大學蔬菜作物系Li等[10]報道的新的分子標記技術，分別由獨特設計的17、l8個堿基組成的上、下游引物優先對基因組DNA開放閱讀框、內含子和啟動子區域進行特異擴增，因不同基因型啟動子、內含子和間隔序列長度不同而產生多態性。其擴增多態性高，所能提供的生物學信息更多，檢測的結果更能反映物種遺傳多樣性和親緣關系。目前此技術已成功應用于柿、枇杷、桃[11-15]等果樹遺傳多樣性的研究。瞿文林等[16]從數量性狀上分析余甘子天然居群果實形態變異；趙瓊玲等[17]采用聚類、主成分分析等方法，分析了14份云南不同種源余甘子植物形態變異的特征規律。目前對余甘子的研究，尚缺乏較系統、有針對性地對不同產地的余甘子資源進行分子水平上的遺傳評價與鑒定分類。因此通過形態學評價，選擇具代表性的22份余甘子種質資源為材料，在前期體系優化的基礎上[18]，利用SRAP分子標記技術研究余甘子資源的遺傳多樣性，可為余甘子種質資源的分類和育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 余甘子試材取自福建省農業科學院果樹研究所余甘子種質資源圃。于2012年春季采集各品種（系）幼嫩葉片，保存于-80 ℃冰箱中備用。共選取22份余甘子種質，其生物學性狀詳見表1。

1.1.2 試劑和儀器 SRAP-PCR所用Mg2+、 dNTPs、Taq DNA聚合酶、標準分子量DNA（DL2000）購自寶生物工程（大連）有限公司，SRAP引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，電泳所用主要試劑甲酰胺、溴酚藍、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、尿素、TBE電泳液均為國產分析純。

1.2 方法

采用改良CTAB法提取基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，以紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，并將濃度稀釋至50 ng/mL。選取已公布的SRAP上下游引物各8條，組成64對引物組合，篩選出擴增多態性好、條帶清晰的引物，對22份材料進行擴增，擴增條件參照Pinmai等[6]的方法。

1.3 統計分析

選取引物在相同基因位點擴增清晰的條帶，根據條帶的有無分別記做“0”和“1”。不同引物擴增的結果構成原始的“0，1”二元數據矩陣，利用NTsys 2.10e分析軟件計算余甘子種質間的遺傳相似度（GS），采用UPGMA法構建聚類圖。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

從64對引物組合中篩選出8對擴增帶清晰、重復性好的引物組合，分別對22份材料的DNA進行PCR擴增， 結果每對引物均能擴增出10條以上清晰的條帶， 最多能擴增出26條條帶。8對引物共產生167條擴增帶（表2），其中135條為多態性帶， 平均每對引物產生20.8條擴增帶、16.9條多態性帶。多態性帶比率為68.8%～90.0%， 平均為80.8%。

2.2 聚類分析

2.2.1 遺傳相似性分析 應用NTsys軟件，根據上述167個位點譜帶0，1數據為原始矩陣，計算22個供試材料兩兩種質間的遺傳相似系數。結果表明， 22份材料GS的范圍為0.641～0.964（表3）。其中福建地區15份余甘子間的遺傳相似系數為0.641～0.964，廣東地區5份余甘子的遺傳相似系數為0.707～0.952。其中收集自福建的“玻璃甘”和廣東的“玻璃甘”同名，但二者遺傳相似系數為0.737，遺傳差異較大，且果形等生物學性狀表現明顯不同，應為同名異物。

2.2.2 聚類結果分析 采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析，結果見圖1。本研究的22份余甘子材料可劃分為兩大類群，A類群包含了本次實驗所選取的6份廣東地區的余甘種質和10份福建地區的余甘種質，B類群包含了2份廣西地區的余甘子和4份福建地區余甘子。其中在相似系數為0.74處，A類群中的16份余甘子可進一步細分成3個小群：A1小群均為福建省地方種質，包含藍豐、六月白、粉甘、棗甘、扁甘、玻璃甘（閩）、南安2號及收集到的野生資源共10份；A2小群均為廣東省地方種質，包含甜種、餅甘、獅頭等4份；A3小群較小，只包含廣東地區的2個種質。

3 討論與結論

余甘子的分類傳統上是依據生物學特性和主要農藝性狀進行歸類。根據不同的成熟期，劃分為極早熟、早熟、中熟、晚熟、一年多熟品種。此外還有以果形、果重、果實風味等劃分方法。但形態學分類容易受環境因素的影響，特別是余甘子作為新興的栽培果樹，由于不同分布區環境條件的差異，各地馴化栽培的農家品種的各種性狀包括樹體性狀、花果性狀、物候期等在不同地域表現變異大，需要更為客觀的鑒定手段。現階段一般采用分子標記方法鑒定種質差別、分析遺傳多樣性，從DNA水平上反映各個基因型之間的內在差異，對余甘子資源的整理分析亦可使用分子生物學方法。

已有學者嘗試使用RAPD對余甘子進行遺傳多樣性分析，蔡英卿等[19]采用20個具特異擴增的多態性引物對福建省34份余甘子基因型進行擴增，20條引物在34份供試材料中總共擴增出259個位點，多態性程度100%，采用ED（歐氏距離）法進行RAPD標記的聚類分析則可將福建34份余甘子遺傳資源明顯劃分為惠安余甘和莆田余甘兩大類，兩類群余甘子資源遺傳背景復雜，遺傳分化程度大。劉曉生等[20]對廣東潮汕地區所收集的17份余甘子資源進行分析，指出17份種質的遺傳相似系數為0.5714～0.9，表現出了較高的遺傳多樣性。而本研究取材范圍進一步擴大，選取了代表余甘子南方濕潤分布區的福建、廣東、廣西部分種質開展了遺傳多樣性的分析。所采用的8個引物組合在22份供試材料中總共擴增出167條譜帶（個位點），多態性比率達80.8%；各供試材料之問的遺傳相似度為0.641～0.964。從前人已發表文獻及本研究結果可以看出：福建、廣東余甘子栽培種質遺傳多樣性均處于較高水平。這體現出余甘子農家栽培品種栽培馴化時間短、馴化起源多的特征。本研究嘗試分析的閩粵黔3省的22份余甘子種質可分為兩大類群，其中A類群包括了多數的福建和所有的廣東余甘子品種，B類群包括了少數福建和廣西的余甘子品種，聚類的結果與資源地理劃分并不一致，這可能是因為地理位置相近，這3個地區的種質歷史曾發生交流。此外分析所得的聚類結果也與果型表現沒有明顯的對應關系。由于余甘子分布地域較廣、適應性強，在不同的生態環境下必然表現出適應當地環境的形態特征，果實性狀是農戶參考辨識品種的依據之一，但由于余甘子種質收集工作起步較晚，所收集品種多數來源于民間，農家品種的命名相對雜亂，存在誤判的可能，這也有可能干擾到聚類結果的準確性。綜上所述，SRAP聚類結果既顯示出一定的地理來源相關性，又存在差別。而農藝性狀的表現受外界環境影響大，筆者認為在特定區域內可使用農藝性狀辨識相近的余甘子種質資源，但類似的性狀并不代表相近的遺傳背景。

參考文獻

[1] 林國華. 常見中草藥（第二輯）[M]. 臺灣： 臺灣好兄弟出版社，1987.

[2] 夏 泉， 肖培根，王立為. 傳統藥物余甘子的民族藥學研究[J]. 中國中藥雜志， 1997， 22（9）： 515-518.

[3] 蔡英卿， 張新文. 余甘子的生物學特性及其應用[J]. 三明師專學報， 2000（1）： 72-74.

[4] 楊順楷， 楊亞力， 楊維力. 余甘子資源植物的研究與開發進展[J]. 應用與環境生物學報， 2008， 14（6）： 846-854.

[5] 程偉賢，陳鴻雁，張義平，等. 余甘子功能食品的開發及其類SOD活力測定[J]. 食品與生物技術學報， 2006， 25（4）： 113-115.

[6] Pinmai K， Chunlaratthanabhorn S， Ngamkitidechakul C， et al. Synergistic growth inhibitory effects of Phyllanthus emblica and Terminalia bellerica extracts with conventional cytotoxic agents：doxorubicin and cisplatin against human hepatocellular carcinoma and lung cancer cells[J]. World J Gastroenterol，2008， 14（10）： 1 491-1 497.

[7] Saito K， Kohno M， Yoshizaki F. Extensive screening for edible herbal extracts with potent scavenging activity against superoxide anions[J]. Plant Foods Hum Nutr， 2008， 63（2）：65-70.

[8] Ghosh A， Das B K， Roy A， et al. Antibacterial activity of some medicinal plant extracts[J]. Nat Med（Tokyo）， 2008， 62（2）： 259-262.

[9] 鄭元福， 楊長山. 余甘子的保健功能及其開發利用的研究進展[J]. 集美大學學報， 1997， 2（1）： 40-44.

[10] LI G， QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction： Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001， 103（3）： 455-461.

[11] 郭大龍，羅正榮. 部分柿屬植物SRAP-PCR反應體系的優化[J]. 果樹學報， 2006， 3（1）： 138-141.

[12] 喬燕春， 林順權， 劉成明， 等. SRAP分析體系的優化及在枇杷種質資源研究上的應用[J]. 果樹學報， 2008， 25（3）： 348-352.

[13] 史紅麗， 韓明玉，趙彩平. 桃遺傳多樣性的SRAP和SSR標記分析[J]. 華北農學報， 2009， 24（6）： 187-192.

[14] 胡文舜， 李 韜， 鄭 姍，等. 43份云南野生枇杷種質遺傳多樣性與親緣關系分析[J]. 福建果樹， 2010（4）： 20-28.

[15] 王鳳華， 賴鐘雄， 陳桂信，等. 果樹DNA分子標記及基因工程若干研究進展[J]. 福建農業大學學報， 2001， 30（2）： 165-170.

[16] 瞿文林， 段日湯， 馬開華，等. 余甘子天然居群果實形態變異研究[J]. 西北植物學報， 2012， 32（12）： 2 444-2 449.

[17] 趙瓊玲， 李 麗， 沙毓滄，等. 云南不同種源余甘子植物形態變異研究[J]. 熱帶作物學報， 2012， 33（1）： 178-181.

[18] 周 平， 許奇志， 熊月明， 等. 余甘子SRAP反應體系的優化[J]. 中國農學通報， 2010， 26（16）： 26-30.

[19] 蔡英卿， 賴鐘雄， 陳義挺， 等. 福建余甘子遺傳資源的RAPD分析[J]. 熱帶作物學報， 2007， 28（2）： 74-79.

[20] 劉曉生， 鄭道序， 周春娟，等. 潮汕余甘子種質資源遺傳多樣性與親緣關系的ISSR分析[J]. 中國南方果樹， 2014， 43（1）：18-22.