海南木豆叢枝植原體質粒全序列測定及分析

李玲婷等

摘 要 提取木豆葉片基因組總DNA，通過克隆，測序木豆叢枝植原體海南株系質粒（pPPWB-Hn）的完整DNA序列，并使用生物信息學軟件對該質粒全長序列進行分析。分析結果顯示：pPPWB-Hn質粒全長4 218 bp，含有4個開放閱讀框，分別編碼Rep、dnaG、threonine synthase和未知蛋白。其中，Rep是2次跨膜蛋白，dnaG是單次跨膜蛋白，Rep和dnaG均與質粒自主復制有關。Rep和未知蛋白可能分布在細胞質中，dnaG可能定位到細胞膜上或膜外，Threonine synthase可能定位到線粒體膜上或線粒體內腔。系統進化樹顯示：pPPWB-Hn與植原體16SrⅡ組的pPNWB（AY270152），pTBBperi（DQ119297）及pTBBcap（DQ119296）處在同一進化分支。

關鍵詞 木豆叢枝植原體；質粒；序列分析

中圖分類號 S432.42 文獻標識碼 A

Abstract The complete nucleotide sequence of plasmid from pigeon pea witches-broom phytoplasma has been determined. The plasmid， pPPWB-Hn， was 4 218 bp in length and contained 4 putative ORFs. ORF1 encoded a replication protein（Rep）with two transmembrane domains. ORF2 encoded dnaG with a single transmembrane domain. ORF3 encoded threonine synthase， and ORF4 encodedan unknown function protein. Threonine synthase and unknownprotein are not transmembrane protein. The Rep and dnaG were relatively to autonomous replication of the plasmid. The Rep， dnaG， threonine synthas and unknownprotein were presumably to be localized to thecytoplasm， the membrane or cytoplasm， the mitochondrial membrane or mitochondrial cavity， and cytoplasmrespectively. The phylogenetic tree showed that the sequence was clustered in the same clade with pPNWB（AY270152）， pTBBperi（DQ119297）and pTBBcap（DQ119296）， which belonged to 16Sr IIgroup phytoplasma。

Key words Pigeon pea witches'-broom phytoplasma； Plasmid； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.026

木豆[Cajanus cajan（L.）Millsp.]又名三葉豆、鴿豆、樹豆，是一種重要的經濟作物和糧食作物[1-2]。在中國木豆主要種植在云南、廣西、海南等地，用于喂養家畜和家禽，枝條可作為柴薪，提取物可制成藥物[3-6]。木豆叢枝病是由植原體引起的一類世界性病害，防治困難，美國的佛羅里達洲，加勒比海地區、牙買加等地種植的木豆均受到該病的侵害[7-8]。中國學者1986年在海南儋縣發現表現叢枝癥狀的木豆植株，通過電子顯微鏡觀察到植原體的存在，通過對木豆叢枝植原體16S rDNA和rp基因的分析，確定引起海南木豆叢枝的植原體屬于16S rⅡ組中的亞組ⅲ[9-10]。目前除臺灣、海南外，中國尚未見其它地區有關于木豆叢枝病的研究報道。

質粒是一種可以自我復制的染色體外DNA分子，1988年首次在玉米叢縮病植原體中發現質粒[11]，目前已在20多種植原體中發現質粒的存在，近年的研究發現，質?？赡茉谥苍w進化，種群多樣性，致病性等方面發揮重要作用，也與植物雙生病毒間存在一定的進化關系，植原體質粒研究已成為植原體致病性研究不可缺少的一部分[12-16]。本研究測定了木豆叢枝植原體的一個完整質粒序列，并利用生物信息學分析對其編碼的蛋白結構及功能進行預測，為進一步研究該質粒功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

木豆叢枝病樣品采自海南儋州，感病木豆植株明顯矮化，節間縮短，葉片變小，叢生，該病害由海南木豆叢枝植原體（Hainan pigeon pea witches'-broom， PPWB-Hn）引起[17]。

1.2 方法

1.2.1 木豆葉片基因組總DNA提取 采用天根生物工程有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒，根據試劑盒操作說明提取木豆基因組DNA。

1.2.2 植原體質粒的克隆 根據已發表的植原體16SrⅡ組質粒Peanut witches'-broom phytoplasma plasmid pPNWB（登錄號：AY270152）和Tomato big bud phytoplasma plasmid pTBBcap（登錄號：DQ119296）序列同源性比對結果，設計PCR擴增引物M-11（5′-TGCGTCGTGGTCATCGTAGT-3′）/M-12（5′-GGGCG

ATAAGGTAATTCTGC-3′）。以表現叢枝癥狀的木豆葉片基因組DNA為模板擴增獲得植原體質粒片段。

木豆叢枝植原體質粒第1次PCR反應采用TaKaRa Taq進行。反應體積25 μL，內含DNA樣品1 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）5 μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.3 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。第2次PCR反應采用TaKaRa LA Taq進行。反應體積25 μL，內含DNA樣品1 μL，10×LA PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各1 μL，LA Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.25 μL，ddH2O 15.25 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35個循環；72 ℃終延伸10 min。第1次及第2次PCR產物均在1%瓊脂糖凝膠電泳中電泳30 min，經Goldview染色，在凝膠成像系統中觀察并拍照。

PCR擴增出的目的DNA片段由TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0純化回收后克隆入pMD18-T載體，轉化E.coli Competent Cell DH5α，利用藍白斑篩選陽性克隆，用PCR反應檢測陽性克隆，序列測定委托上海立菲生物技術有限公司完成。

1.2.3 序列分析 序列裝配及特征簡析利用DNAman分析軟件，開放閱讀框預測采用NCBI網站的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），序列同源性比較分析采用NCBI網站的BLAST（Basic Local Alignment Search Tools）工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），串聯重復序列分析使用RepeatMasker程序（http：//www.repeatmasker.org/），跨膜區預測使用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/），亞細胞定位使用TargetP 程序預測（http：//www.cbs.dtu.dk/）。系統進化樹分析采用MEGA4.0.2，

2 結果與分析

2.1 pPPWB-Hn的克隆及分子特征

2.1.1 pPPWB-Hn的克隆 以表現叢枝癥狀的木豆葉片基因組DNA為模板，用引物M-11/M-12進行第1次PCR擴增獲得長度1 189 bp的片段pPPWB-Hn F1（圖1），根據pPPWB-Hn F1片段的序列設計反向PCR引物NM-1（5′-CCACTAAATAAGATGC

CTGAAA-3′）/NM-2（5′-GCCGTATTATGCGGTAGAT

T-3′）進行第2次PCR擴增，獲得長度3 383 bp的片段pPPWB-Hn F2（圖2），將2條末端重疊的片段pPPWB-Hn F1和pPPWB-Hn F2使用DNAMAN6.0進行序列拼接裝配，最終得到長度4 218 bp的環狀質粒，命名為pPPWB-Hn（GenBank登錄號：KC935372）。

2.1.2 pPPWB-Hn的分子特征 pPPWB-Hn序列中A+T占72.85%，用NCBI網站BLAST進行同源性分析可知pPPWB-Hn和pPNWB有97.82%的同源性，與pTBBcap有95%的同源性。串聯重復分析發現pPPWB-Hn含有2個簡單重復序列，第1個位于ORF3和ORF4之間的非編碼區（2 912～2 931 bp），長度為20 bp（AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA），第2個也位于ORF3和ORF4之間的非編碼區（3 618～3 637 bp），長度為20 bp（TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT）。

用NCBI的ORF Finder分析可知，質粒一共有4個編碼大于100個氨基酸的開放閱讀框，其中ORF1、ORF2、ORF4的方向一致，ORF3與上述3個開放閱讀框方向相反（圖3）。將pPPWB-Hn編碼的4個蛋白氨基酸序列利用NCBI網站的protein BLAST進行（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比較，ORF1與pPNWB編碼的Rep蛋白同源性最高，達到95%，ORF2與pPNWB編碼的dnaG蛋白同源性最高，達到99%，ORF3與pPNWB編碼的蘇氨酸合成酶（Thr synthase）蛋白同源性最高，達到100%，ORF4與pPNWB編碼的一個未知蛋白同源性最高，達到88%（表1）。

2.2 pPPWB-Hn編碼的蛋白跨膜結構預測

使用TMpred程序對序列編碼的4種蛋白進行跨膜區預測（http：//www.ch.embnet.org/），結果表明，ORF1編碼的Rep蛋白具有1個從膜外向膜內的跨膜區（AA：249～273）和1個從膜內向膜外的跨膜區（AA：334～353）；ORF2編碼的dnaG蛋白是個單次跨膜蛋白（AA：292～308），且N端位于膜外側；ORF3編碼的Threonine synthase和ORF4編碼的未知蛋白沒有跨膜區出現。

2.3 pPPWB-Hn編碼的蛋白亞細胞定位預測

使用TargetP 程序預測亞細胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/），見表2所示，4種蛋白都不含葉綠體定位信號，ORF1編碼的Rep和ORF4編碼的未知蛋白不含線粒體定位序列及信號肽序列，可能分布在細胞質內，ORF2編碼的dnaG含有信號肽序列，信號值為0.891，可能進入分泌途徑定位到細胞膜上或膜外，ORF3編碼的Threonine synthase含有線粒體定位信號肽，信號值為0.764，可能定位到線粒體膜上或線粒體內腔（表2）。

2.4 系統進化樹分析

從系統進化樹可以看出：pPPWB-Hn與植原體16SrⅡ組的pPNWB（AY270152），pTBBperi（DQ119297）及 pTBBcap（DQ119296）處在同一進化分支（圖4）。

3 討論與結論

質粒數目和大小在不同植原體中均不相同，已報道的最大植原體質粒為葉蟬傳甜菜綠化植原體質粒（pBLTVA-1），大小為10 785 bp，最小的質粒為葉蟬傳甜菜綠化植原體質粒（pBLTVA-2），大小為2 587 bp，大多數植原體質粒序列長度在3 000 ～5 000 bp之間[16]。本研究測定了中國木豆叢枝植原體海南株系一個質粒pPPWB-Hn的完整DNA序列，其大小為4 218 bp，利用生物信息學軟件預測該質粒編碼4個蛋白，除包括所有植原體都含有的與質粒復制有關的Rep蛋白外，還包括1個DNA 引物酶蛋白（dnaG）、1個蘇氨酸合成酶蛋白和1個未知功能的蛋白。對質粒的系統進化分析表明，pPPWB-Hn與16SrⅡ組植原體質粒處在同一進化分支，這與根據16S rDNA進行的植原體分類結果一致[10]，這表明除了利用16S rDNA序列對植原體進行分類外，質粒序列也可作為植原體分類的依據。

目前，NCBI上已公布的植原體質粒全序列有80多個，但多數是16SrⅠ組成員，植原體16SrⅡ組質粒僅有pPNWB、pTBBcap和pTBBperi等公布。pPPWB-Hn與pPNWB相比：ORF1少84個堿基，全序列長度相近，ORF數量、編碼的蛋白功能和表達方向均相同；pPPWB-Hn與pTBBcap、pTBBperi相比差異較大：pTBBcap僅3個ORF，ORF的位置和大小差別較大，pPNWB質粒Rep基因的大小差不多是pTBBcap和pTBBper的2倍，這可能和寄主植物、介體昆蟲及地理生態環境有關。關于木豆叢枝植原體體內是否還存在其它質粒以及植原體質粒在病原與寄主植物互作中的作用還有待進一步研究。

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