原核表達dsRNA抗番木瓜畸形花葉病毒的研究

張濤等

摘 要 番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）是一種已對番木瓜種植業構成潛在威脅的新型病害，在轉基因植物備受爭議的背景下，利用原核表達的dsRNA來防控病毒的策略不失為一種新的選擇。本文選取PLDMV CP基因全長（879 bp），運用OZ-LIC法構建了含有pdk內含子的ihpRNA結構，將其嵌入原核表達載體pSP73中，并轉化RNaseⅢ缺陷型大腸桿菌M-Jm109LacY，構建了1種能高表達dsRNA的原核表達菌株M-Jm109LacY-CP879，以終濃度為0.4 mmol/L IPTG誘導后能夠穩定高效的表達CP879-dsRNA。研究共設2個處理：保護性處理與治療性處理。分別用含有CP879-dsRNA的粗提液對這2個處理的番木瓜植株進行噴施處理，通過統計發病率、觀察病癥變化以及ELISA分析結果表明，保護性處理能有效抑制番木瓜畸形花葉病毒的侵染，主要表現為發病時間推遲和相對較低的發病率；治療性處理植株的病毒積累量會在噴施后第3～12天內出現暫時性的降低。結果表明，保護效果優于治療效果，若每月噴施2～3次dsRNA粗提液，有望能夠有效地預防PLDMV的侵染。

關鍵詞 番木瓜畸形花葉病毒；原核表達；dsRNA；RNA沉默

中文分類號 S667.97 文獻標識碼 A

Abstract Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）is a potential threat to papaya cultivation. Nowadays， transgenic plants is highly controversial， and using the prokaryotic expressed dsRNA to control the virus could be a new choice. The full length of PLDMV CP gene（879 bp）was chosen to construct a hairpin RNA structure which contains pdk intron by OZ-LIC method. After the coding structure of hairpin RNA inserted into the prokaryotic expression plasmid of pSP73， the recombinant vector was transformed into the RNaseⅢ-deficient Escherichia coli strain of M-Jm109LacY. Then a prokaryotic expression strain with high expression level of CP879-dsRNA was successfully constructed， named M-Jm109LacY-CP879. The recombinant E. coli strain could express CP879-dsRNA stably when induced with IPTG at 0.4 mmol/L. There are two assays in this study：a protective resistance assay and a therapeutic resistance assay. In the protective assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plant leaves before inoculation of PLDMV. The disease incidence， symptom change and ELISA analysis results revealed that the CP879-dsRNA could inhibit the virus' accumulation. In the therapeutic assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plants that had been inoculated with PLDMV after 25 days. ELISA analysis results showed that the virus accumulation declined temporarily during the 3th to 12th day after spraying with CP879-dsRNA.The results showed that the effect of protective treatment was better than that of therapeutic treatment. If sprayed with CP879-dsRNA two or three times a month， the plants may be able to prevent PLDMV infection.

Key words Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）； Prokaryotic expression system； dsRNA； RNA silencing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.028

番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）為馬鈴薯Y病毒屬（Portyvirus）病毒，于1954年在日本沖繩島北部地區首次發現，起初因其所引發的病癥與番木瓜環斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）相似，沖繩島上的木瓜病一度被認為是由PRSV引起的，不過進一步的電子顯微鏡和血清學研究揭示出其是馬鈴薯Y病毒屬中的一種新病毒，隨后被命名為番木瓜畸形花葉病毒[1]。之后在美國塞班島[2]、中國臺灣[2]和海南[3]等地也相繼被發現。該病毒是繼PRSV之后發現的又一種極具毀滅性的番木瓜病害之一，另外因其能夠侵染抗PRSV的轉基因番木瓜，故其對木瓜種植業發展已構成了潛在的威脅[4]。利用轉基因技術培育同時能抗PRSV和PLDMV的番木瓜植株為最有效的方法[5]，但由于公眾對轉基因農作物的安全性一直心存疑慮，其市場推廣依然存在著極大阻礙。因此，研發一種安全有效的PLDMV防控新策略具有重大意義。

RNA沉默（RNA scilencing）是生物體外源或內源的dsRNA進入到細胞中，特異性的降解與其同源的mRNA，從而抑制相關基因表達的現象[6]。這為植物能有效的對抗病毒帶來了新的曙光[7]。雙鏈RNA（dsRNA）在RNA沉默中扮演著極為關鍵的角色，只有較大劑量的dsRNA才能誘導RNA沉默的發生[8]。國內外大量研究表明，利用原核表達的dsRNA能夠有效保護植物不被病毒侵染，且相對于能表達dsRNA的轉基因抗病毒植物更加安全、便捷。最初的研究是由Tenllado等[9]發起的，該研究團隊用辣椒輕斑駁病毒（Peppermild mottle virus，PMMoV）復制酶基因的部分序列（IR54），構建了能表達ihpRNA結構的原核表達載體pGEM/IR54，并將其轉化HT115（DE3）菌株來構建其原核表達體系，然后用經IPTG誘導過的重組菌株制備成高壓細胞破碎液，直接噴施到煙草上，可使煙草在一定時期內對PMMoV產生抗性。張德詠等[10]用黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）AN株系的CP基因作為中間間隔序列，構建了含有CMV P3613株系MP基因的ihpRNA原核表達載體，并轉化HT115（DE3）菌株，用其超聲波破碎液噴灑煙草，分別進行保護性處理和治療性處理，能起到較好的保護效果，抗病效率分別為為55%和25%。Yin等[11]利用煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）CP基因構建了原核表達載體pGEM-CP480并轉化M-JM109lacY菌株，將表達得到的dsRNA與TMV混合接種到煙草葉片上，結果僅有40%的植株發病。Gan等[12]利用pUCCRNAi載體構建了含有甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，ScMV）CP基因部分序列的發卡RNA結構，并轉化HT115（DE3）菌株，將相應的dsRNA粗提液噴施到玉米植株上，能有效誘導玉米抵御ScMV的侵染。鄭海剛等[13]將原核表達的dsRNA通過摩擦接種法，誘導了黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的抗性，抗病效率為40%。楊國峰等[14]構建了番木瓜環斑病毒PRSV HC-Pro基因的dsRNA原核表達體系，并用其高壓細胞破碎液直接噴施番木瓜植株，能高效誘導番木瓜植株對PRSV產生抗性，抗病效率達到50%。本研究利用OZ-LIC[15]（One-step，zero-background ligation-independent cloning）法構建了PLDMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因全長dsRNA的原核表達體系，并用dsRNA高壓細胞破碎液對番木瓜植株分別進行保護性處理和治療性處理，以探究在體外利用原核表達的dsRNA生物制劑防治番木瓜畸形花葉病毒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 株高25 cm左右的‘穗中紅48（Suizhonghong-48）非轉基因番木瓜健康組培苗，由本實驗室培養保存。

1.1.2 質粒與菌株 RNaseⅢ缺陷型大腸桿菌M-Jm109LacY為朱常香教授（山東農業大學）惠贈。pRNAi-LIC載體由劉玉樂教授（清華大學）惠贈。番木瓜畸形花葉病毒海南株（PLDMV-HN-DF）由本實驗室分離保存。含有PLDMV全長的cDNA克隆（GenBank登錄號：JX974555.1）由本實驗室保存。pSP73原核表達載體購自Promega公司。

1.1.3 主要試劑和酶 Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，DNA回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，T4 DNA聚合酶以及各種限制性內切酶購自Fermentas公司，2×Eco Taq Super PCR Mix，Trance10感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司，Trizol試劑購自Ambion公司，ELISA檢測所用的PLDMV CP兔抗血清由本實驗室制備，酶標抗體堿性磷酸酯酶羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術有限公司。其它試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 引物設計參照OZ-LIC法進行，引物序列中用虛線標記部分為與pRNAi載體上相對應的接頭序列（LIC1～4），引物序列中用實線標記部分為引入的酶切位點，這是為了便于將發卡結構從pRNAi-LIC載體上切下，并轉接到pSP73原核表達載體上而設計的，筆者分別在2個將要擴增的目的片段的5′端設計了2個限制性酶切位點：XhoⅠ和KpnⅠ。擴增dsRNA正向序列的引物LIC1-879上的酶切位點為XhoⅠ，擴增dsRNA反向序列的引物LIC4-879上的酶切位點為KpnⅠ，最后交由Invitrogen公司合成（表1）。

1.2.2 原核表達載體的構建 PLDMV CP基因全長的克隆：使用Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，以含有PLDMV全長cDNA克隆的質粒為模板擴增目的片段，引物LIC1-879，LIC2-879擴增所得的PCR產物1作為構建dsRNA發卡結構的正向序列；引物LIC3-879，LIC4-879的擴增所得的PCR產物2作為構建dsRNA發卡結構的反向序列。擴增所得的2個產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，將目的條帶回收并純化。

含有pdk內含子的發卡RNA結構的構建：①在PCR管中依次加入1 μL 5×reaction buffer，2 μL純化過后PCR產物1/PCR產物2（約50 ng），0.25 μL dATPs（100 mmol/L）和0.1 μL T4 DNA聚合酶（約0.5 Units），1.65 μL ddH2O 后于22 ℃反應30 min后，再經75 ℃ 處理20 min使T4 DNA聚合酶失活；②用限制性內切酶SmaⅠ對載體 pRNAi-LIC進行酶切處理，37 ℃酶切30 min后經65 ℃處理20 min使SmaⅠ失活；③在PCR管中加入10 μL 5×reaction buffer，36.5 μL經SmaⅠ消化過的pRNAi-LIC載體，2.5 μL dTTPs（100 mmol/L）和1 μL T4 DNA polymerase，反應條件同步驟1；④取3 μL經過步驟3處理過的pRNAi-LIC載體，同經過步驟1處理過的2種PCR產物混合，先經65 ℃ 處理 5 min，然后于22 ℃ 連接15～30 min；⑤將連接好產物轉化大腸桿菌 Trans10感受態細胞，均勻涂布于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素固體LB平板上，37 ℃倒置培養16～20 h后篩選重組子。構建好的發卡RNA結構應如圖1所示。

發卡RNA結構的酶切鑒定：從轉化的平板上挑取單個菌落接種于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素的液體LB中，震蕩培養過夜后提取質粒做酶切鑒定。共做了2種酶切鑒定：若質粒構建成功，則用SacⅠ和BamHⅠ酶切后，經1%瓊脂糖凝膠電泳可見到3條帶。經XhoⅠ和KpnⅠ酶切可產生4條帶，其中一條為編碼發卡RNA結構的目的條帶。

dsRNA原核表達載體的構建與鑒定：回收并純化從pRNAi-LIC載體上酶切下的發卡結構DNA片段，與同樣經XhoⅠ和KpnⅠ酶切處理過的載體pSP73按3 ∶ 1比例混合，添加T4 DNA連接酶后4 ℃連接過夜；取連接產物轉化由M-Jm109LacY菌株制備的感受態細胞，均勻涂布于含有50 μg/L kan和50 μg/L Amp的固體LB平板上，37 ℃倒置培養16～20 h；挑取單菌落搖菌后用引物LIC3-879和LIC4-879做菌液PCR鑒定。同時用pSP73空載體構建的菌株M-Jm109LacY/pSP73作為陰性對照。

1.2.3 dsRNA的誘導表達 將構建成功的重組菌株接種至10 mL含50 μg/L Kan與50 μg/L Amp LB液體培養基中37 ℃，250 r/min振蕩培養過夜，然后將菌液全部加入到200 mL LB液體培養基（抗性同前）中于37 ℃，250 r/min振蕩培養約2 h，直至A600 nm=0.5左右，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG于37 ℃，250 r/min誘導培養約3 h后，離心收集菌體后用Trizol試劑提取總RNA。對提取得到的RNA樣品分別先后用DNaseⅠ與RNaseA進行消化處理。具體步驟為：向PCR管中依次加入2.0 μL RNA樣品（約1 μg），1.0 μL 10×DNaseⅠBuffer，1.0 μL DNaseⅠ（1 U/μL），6.0 μL ddH2O，于37 ℃恒溫水浴30 min；取5.0 μL 經DNaseⅠ消化過后的RNA樣品，加入6 μL NaCl（1 mol/L），0.5 μL RNase A（1 ng/μL），于37 ℃恒溫水浴1 h；用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA以及2種消化產物進行分析。

1.2.4 dsRNA粗提液的制備 將誘導后的菌液離心收集菌體，用含有10 mmol/L Tris（pH=7.5），1 mmol/L EDTA緩沖液對菌體進行重懸，然后使用高壓細胞破碎儀（Constant Systems公司，英國）對收集到的菌體以0.98 kPa的壓強進行破碎處理。

1.2.5 使用dsRNA粗制品處理番木瓜植株 研究共設2個處理，一為保護性處理，另一為治療性處理，每處理均設3個重復。將保護性處理分為2個組，每組30株苗，一組噴施CP879-dsRNA粗提液，另一組噴施經IPTG誘導的轉入pSP73空載體的細胞破碎液作為對照。葉片的正反兩面均須噴施均勻。于噴施后的第2天，摘取取新鮮的PLDMV病葉配以適量石英砂以及PBS緩沖液進行研磨，之后取其汁液人工摩擦接種到2組番木瓜植株的葉片上，每天觀察并記錄植株的發病情況。每組中隨機選取3株苗進行取樣，依次于接種后的第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天剪取位于被接種過的葉片以上的葉片進行ELISA分析。治療性處理同樣分為2個組，每組選取30株苗，均為接種PLDMV 25 d后已表現出病癥的番木瓜組培苗。一組噴施CP879-dsRNA粗提液，另一組噴施經IPTG誘導的轉入pSP73空載體的細胞破碎液作為對照。每天觀察發病情況。每組中隨機選取3株番木瓜苗進行取樣，依次于噴施前（0 d）和噴施后的第3、6、9、12、15、18天剪取取樣株頂部病葉進行ELISA分析。

1.2.6 噴施CP879-dsRNA后番木瓜植株中的病毒積累量的測定 本研究中ELISA檢測采用的是雙抗體夾心法（DAS ELISA）。用包被緩沖液將PLDMV CP兔抗血清稀釋至1～10 μg/mL，然后吸取100 μL加入到到每個聚苯乙烯板的反應孔中，4 ℃包被過夜；次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min；取新鮮的病葉研磨后離心取上清，吸取100 μL加入到上述已包被的反應孔中，于濕盒中37 ℃溫育1 h后進行洗滌（同步驟2），同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔；于各反應孔中，加入100 μL現配的按1 ∶ 3 000的比例稀釋的堿性磷酸酯酶羊抗兔IgG。37 ℃溫育1 h后洗滌（同步驟2）；于各反應孔中加入100 μL臨時配制的PNP（1 mg/mL）底物溶液，于室溫（25 ℃）避光溫育30 min；于各反應孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸以終止反應；用酶標儀在405 nm波長下，以空白對照孔調零后測各孔OD值，分析各處理的保護效果。試驗組的OD值/陰性對照的OD值若大于2.1則可判斷為陽性，若小于2.1則可判斷為陰性。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆

以含PLDMV全長的cDNA的質粒為模板，引物LIC1-879，LIC2-879擴增得到了構建dsRNA發卡結構的正向序列，引物LIC4-879，LIC3-879擴增得到了構建dsRNA發卡結構的反向序列，片段大小均約為879 bp。擴增結果如圖2所示。

2.2 dsRNA發卡結構的酶切鑒定

2種酶切鑒定結果如圖3所示：經SacⅠ和BamHⅠ酶切后產生了3條片段，第1條片段的大小為9.7 kb，第2條片段的大小為1 932 bp，最后1條片段的大小為1 501 bp。經XhoⅠ和KpnⅠ酶切共產生了4條片段，其中第2條片段即為需要回收的發卡結構，片段大小約為3 369 bp，所有片段大小均與預期結果一致。說明dsRNA發卡結構已經構建成功，將構建成功的質粒命名為pRNAi-CP879。

2.3 dsRNA的表達分析

用Trizol試劑提取的細菌總RNA及其酶解結果如圖4所示，將轉入重組質粒的菌株所提取的RNA樣品經DNaseⅠ和RNaseA先后處理后，目的條帶（圖4中約879 bp處）不會被消化掉（因RNaseA在高鹽下消化，故條帶遷移速率比其它樣品慢），而由M-Jm109LacY/pSP73對照菌株所提取的RNA樣品會被消化掉，證明經IPTG誘導表達出的RNA樣品主要是dsRNA，將該dsRNA命名為CP879-dsRNA。

2.4 CP879-dsRNA處理后番木瓜植株的發病情況

對于保護性處理，在接種PLDMV后第18天時，部分對照組植株的頂部嫩葉開始顯現出病癥，而噴施dsRNA粗提液的實驗組植株均沒有植株發病；第24天時，對照組植株已全部發病，而實驗組植株總共只有5株發病；截至第30天時，實驗組植株仍有有14株苗未發病（表2）。與對照組100%發病率相比，實驗組植株的發病率僅為47%。保護性處理中不同植株的病癥見圖5A。

對于治療性處理，在噴施CP879-dsRNA后的18 d內，對照組植株葉片病癥狀逐漸加重，由最初的泡狀突起、葉脈發白、花葉發展到新生嫩葉卷曲、皺縮和嚴重畸形；而實驗組植株在噴施CP879-dsRNA粗提液后第10天左右，部分植株葉片出現癥狀減輕的現象，甚至有部分植株頂部長出了沒有病癥的新葉，但在隨后的一周時間里，葉片病癥又逐漸加重（圖5B）。

2.5 CP879-dsRNA 處理后番木瓜植株中PLDMV積累量

在保護性處理中，陰性對照組植株的A405 nm=0.107±0.009。陽性對照組植株在接種PLDMV后第12天以前的ELISA檢測結果均呈陰性，第12天及12天之后的ELISA檢測結果均呈陽性，且隨后病毒積累量不斷升高；而噴施過CP879-dsRNA粗提液的處理組植株在第18天時，ELISA檢測結果才呈現出陽性，比陽性對照晚了近一周，且各植株中的病毒積累量均顯著低于同一時間內的對照組植株（圖6）。

在治療性處理中，陰性對照組植株的A405 nm=0.104±0.012，噴施M-Jm109LacY/pSP73細胞破碎液的陽性對照組植株中的病毒積累量隨著時間的推移不斷升高，而噴施CP879-dsRNA粗提液的處理組植株在第3～12天內的病毒積累顯著低于陽性對照組植株，但隨后病毒積累量又逐日升高，直至第15天時與陽性對照組植株已無顯著差別（圖7）。

3 討論與結論

根據病毒基因能夠被與其自身基因同源的特異dsRNA沉默的機制，常規的方法為利用基因工程技術構建相關病毒基因的dsRNA植物表達載體轉入到植物中，從而獲得相應的抗病毒轉基因植株。該方法已應用到煙草[16-17]，大麥[18]，大豆[19]，葡萄柚[20]，馬鈴薯[21]等眾多農作物上。但是近年來關于轉基因農作物潛在的生態風險和食品安全性問題一直備受爭議，轉基因植物的推廣也因此變得異常艱難，而通過原核大量表達的dsRNA對植物進行體外噴施處理則相對來說更安全和高效。傳統的構建dsRNA發卡結構的方法通常需要多步酶切與連接反應，操作復雜。而本研究所用的OZ-LIC法不需要使用T4 DNA連接酶，幾乎零背景，只需用T4 DNA聚合酶的外切酶活性分別將載體、正向序列與反向序列切出能夠互補的粘性末端后，進行一步連接反應即可完成發卡RNA結構的構建。與傳統法相比非常簡單、迅速。

RNA沉默具有高度的特異性，若要dsRNA的沉默效率高，則所選用的dsRNA序列與被沉默的基因需要具有高度的同源性[22]。另外Wesley等[23]的研究結果表明，發卡RNA在RNA沉默中起到決定性作用的結構是其莖環結構中“莖”的那一部分。且“莖”越長，沉默效果就越好，但是太長又會不利于發卡結構的穩定性[24]。本研究為了保障dsRNA能同時具備較高的沉默效率與穩定性，特別挑選了PLDMV CP基因全長（879 bp）來構建dsRNA，最終表達得的dsRNA在DNaseⅠ和RNase A同時存在的情況下不易被降解。由此表明CP879-dsRNA能在體外穩定存在，具有較高的穩定性。

RNA沉默具有高效性和擴散性的特點，RISC復合物切割靶標RNA這一過程會被一種依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）所識別，RdRp能夠以dsRNA為模板擴增dsRNA，經過多次循環使得dsRNA大量積累，從而進一步放大RNA沉默的信號，與此同時基因沉默抑制子（Suppressor of Gene silencing，SGS）能夠穩固dsRNA底物以幫助DCL蛋白生成更多的次級siRNA，從而增強RNA沉默效應[25]。另外Fire等[6]發現，將dsRNA注射到線蟲體內，這些dsRNA可以從注射處的細胞擴散到體內其他細胞，引起其他細胞的基因沉默。對于保護性處理，在向植株接種病毒之前，通過外源dsRNA誘導，植物不同組織細胞內已積累了一定量siRNA，而通過蚜蟲或機械摩擦引入的病毒是局部的、微量的，在病毒還沒來得及大量增殖的時候，這些siRNA便能夠從源頭上抑制病毒的復制，從而阻止病毒向植株其他組織細胞擴散。而在治療性處理中，病毒已對植株造成了系統性侵染，病毒粒子遍布不同組織細胞，此時噴施dsRNA雖也能誘導siRNA生成，但由于病毒積累量較大，且通過這一方式所產生的siRNA并不是永久性的，因此只能在短期內發揮作用，并不能徹底清除植株內病毒，這或許是保護性處理的效果要優于治療性處理的原因。

本研究構建的番木瓜畸形花葉病毒CP基因全長dsRNA原核表達體系，在保護性處理中，噴施CP879-dsRNA粗提液能夠有效誘導木瓜苗對PLDMV的抗性。對于治療性處理，它能夠在短期內抑制PLDMV積累，部分植株出現癥狀減輕的現象，但隨后PLDMV積累量又逐步升高，病癥愈發嚴重。由此可以看出，保護處理的效果要優于治療性處理，這一結果與張德詠[10]和楊國峰[14]所得結果相似。可以預見，在大田生產上，于PLDMV的高發期，若每個月對未感病的番木瓜植株噴施2～3次CP879-dsRNA粗提液，或許能夠有效預防PLDMV對番木瓜植株的侵染。但具體的施用濃度與施用量仍有待于進一步驗證與研究。

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