貴州侗族酸肉中一株抗氧化彎曲乳桿菌LAB26的鑒定及特性

湛劍龍

摘 要：從貴州侗族酸肉中篩選出一株乳酸菌，其DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原能力、抗脂質過氧化能力分別為（59.67±6.68）%、（153.17±5.50）%、（47.31±4.62）%、（55.00±5.19）%，并且菌株有良好耐受NaCl和NaNO2的性能。

關鍵詞：乳酸菌；抗氧化；特性

Abstract： A strain of lactic acid bacteria was selected from sour meat of the Dong ethnic minority in Guizhou， China. Its DPPH and hydroxyl radical scavenging activities， reducing power and anti-lipid peroxidation activity were （59.67 ± 6.68）%， （153.17 ± 5.50）%， （47.31 ± 4.62）% and （55.00 ± 5.19）%， respectively. Moreover， the strain had good tolerance to NaCl and NaNO2.

Key words： lactic acid bacteria； antioxidant activity； characteristics

中圖分類號：TS252.54 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）06-0001-04

乳酸菌的主要功能有降低膽固醇、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤等[1-4]。其中抗氧化能力為一般保健品所具有的功能，能清除人體自由基、防止DNA損害、延緩衰老[5]。篩選抗氧化乳酸菌具有重要意義。抗氧化乳酸菌的菌種特性已經有類似的研究[6-7]，深度發(fā)掘了乳酸菌的功能特性，對乳酸菌的生產應用打下基礎。但還是有一些局限性，如不同地區(qū)，地域的乳酸菌的性能是否一致，乳酸菌在抗氧化方面的能力是否都很強，主要由什么指標體現。乳酸菌類型繁多，資源豐富，制作食物或發(fā)酵產品的材料和方法隨地區(qū)不同（各種地域環(huán)境中的自然菌群不同），當地風俗習慣的不同而有很大差異，得到的乳酸菌也不同，結果也不一定相同[8-12]。本實驗以一種貴州侗族酸肉為材料，篩選出一株乳酸菌，以DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原能力、抗脂質過氧化能力為抗氧化能力篩選指標，以期為抗氧化的乳酸菌的篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸肉6號樣品（SR6）采自江縣餅妹鎮(zhèn)鑾里村，采樣時嚴格按照GB/T 4789.1—2010《食品安全國家標準：食品微生物學檢驗總則》操作。

MRS肉湯培養(yǎng)基﹑PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基（PY培養(yǎng)基中添加10g/L葡萄糖） 北京陸橋技術有限責任公司；結晶紫 天津市致遠化學試劑有限公司；草酸銨 天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；碘片 天津博迪化工股份有限公司；碘化鉀 天津市化學試劑供銷公司；無水

乙醇 天津市富宇精細化工有限公司；過氧化氫 重慶

江川化工有限公司；甲基紅﹑1，10-菲咯啉 天津市科密歐化學試劑有限公司；α-萘酚 國藥集團試劑有限公司；氫氧化鉀 東莞市東旺化玻儀器有限公司；細菌微量生化鑒定管（葡萄糖）﹑細菌微量生化鑒定管（麥芽糖）﹑細菌微量生化鑒定管（乳糖） 青島高科園海博生物技術有限公司；葡萄糖﹑氯化鈉﹑亞硝酸鈉﹑鐵氰化鉀﹑三氯化鐵﹑磷酸氫二鈉 成都金山化學試劑有限公司；乳糖 天津市大茂化學試劑廠；二苯代苦味肼基自由基 日本進口原裝 TCI；硫酸亞鐵 天津市永大化學試劑有限公司；三氯乙酸﹑硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀 上海廣諾化學科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；S1000TM Thermal Cycler PCR儀、Gel DocXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Gilson P型移液器 法國吉爾森公司；Micro 17R微量高速冷凍離心機 美國Thermo Electron公司；

XW-80A渦旋混合器 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化與保存

采用平板稀釋涂布法進行菌落分離。取3 g樣品，接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。稀釋8個梯度（10-1～10-8）后涂布滅菌的MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，再采用平板劃線法依次接種于MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑出平板上生長較好的單菌落進行革蘭氏染色，進行鏡檢，觀察并記錄該菌株的形態(tài)大小和顏色。直到最終的鏡檢結果和上次的結果一致，并且沒有雜菌，可停止對該菌種的分離純化。將純化后的菌株―18 ℃保存于30%MRS液體培養(yǎng)基中備用。

1.3.2 生理生化實驗

1.3.2.1 甲基紅實驗

接種SR6于5 mL PYG培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)48 h后加入甲基紅指示劑，如指示劑變紅，則為陽性，出現黃色則為陰性。

1.3.2.2 乙酰甲基甲醇實驗（V-P實驗）

接種SR6菌株于裝有5 mL PYG培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)48 h后在其中加入1.2 mL試劑A（a-萘酚純酒精溶液）和0.4 mL試劑B（40%KOH水溶液），并進行振蕩，陽性菌常立即呈現紅色，若無紅色出現，靜置于室溫或37 ℃恒溫箱，如2 h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。

1.3.2.3 淀粉水解實驗

接種SR6于裝有2 mL PYG液體培養(yǎng)基的實管中，放入36 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，再加入2～3 滴碘液前進行振蕩，滴加碘液后，若出現藍色，再進行振蕩觀察藍色是否消失。通過現象觀察，可以判斷淀粉是否水解或完全水解。

1.3.2.4 過氧化氫酶實驗（觸酶實驗）

直接滴加3%過氧化氫于裝有備有菌種的PYG培養(yǎng)基中，立即觀察，有大量氣泡產生者為陽性，不產生氣泡者為陰性。

1.3.2.5 葡萄糖產酸實驗

使用細菌微量生化鑒定管（葡萄糖）進行測定。接種SR6菌株50 μL于安瓿瓶中，振蕩均勻，于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化。出現黃色則為陽性。

1.3.2.6 麥芽糖﹑乳糖發(fā)酵實驗

采用細菌微量生化鑒定管進行測定，實驗方法與葡萄糖產酸實驗相同。

1.3.3 DNA提取

按照細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。

1.3.4 PCR擴增細菌16S rRNA全長[13]

1）采用細菌通用引物：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5- GGTTACCTTGTTACGACTT-3；2）25 μL反應體系：1 μL模板DNA，引物（1 μmol/L）

各2.5 μL，Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL，去離子水6.5 μL；3）反應程序：95 ℃預變性2 min；25個循環(huán)：94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；最終72 ℃延伸2 min。用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

取PCR擴增產物送上海生工公司進行測序分析，在ABI DNA自動測序儀上進行測序反應。登陸NCBI網站，與已知基因序列進行比對。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 菌懸液的制備

供實菌于MRS 培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液3500 r/min 離心10 min，收集菌體，并用PBS洗滌3 次，最后用PBS將乳酸菌的菌數調整到109 CFU /mL，即為待測菌體（IC）[6]。

1.3.5.2 抗氧化能力的測定

菌體清除DPPH自由基的能力實驗：參照文獻[14]進行；菌體清除羥自由基能力實驗：參照文獻[14]進行；菌株還原能力實驗：參照文獻[6]進行；菌株抗脂質過氧化能力測定：參照文獻[14]進行。

1.3.6 菌種特性研究

1.3.6.1 生長曲線的測定

接種后每2 h即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h用分光光度計于波長600 nm測吸光度，最后根據以生長時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.6.2 pH值的測定

SR6菌株直接接種于MRS培養(yǎng)基中，并放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每2 h進行pH值測定。

1.3.6.3 耐鹽性實驗

SR6菌株分別接種于添加了0%、2%、4%和6% NaCl溶液的MRS培養(yǎng)基中，并放于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于波長600 nm測吸光度。

1.3.6.4 耐硝性實驗

SR6菌株分別接種于添加0、50、100 mg/kg和150 mg/kg NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基。37℃ 培養(yǎng)24 h后，于 600 nm測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 菌株的菌落特征和菌體形態(tài)

編號：SR6；菌落特征：微透明，凸起，光滑圓整，直徑（1±0.3）mm；鏡檢菌體形態(tài)：G+，無芽孢，鏈狀，桿菌。

2.2 生理生化實驗

3 結 論

本實驗從貴州省侗族酸肉樣品中篩選得到一株彎曲乳桿菌LAB26（Lactobacillus curvatus strain LAB26）。具有較強抗氧化能力：其DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原能力、抗脂質過氧化能力分別為（59.67±6.68）%、（153.17±5.50）%、（47.31±4.62）%、（55.00±5.19）%。SR6生長周期較短，調整期0～2 h、對數期2～14 h、穩(wěn)定期14～20 h、20 h以后進入衰亡期。SR6在含6%NaCl的MRS培養(yǎng)基中生長狀況依然良好，并且對NaNO2有很好的耐受力。

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