代謝性標記結合二維電泳尋找O—糖基化蛋白的研究

申浩 張秀 張蕾 張延

摘 要：蛋白質的o-糖基化（O-glycosylation）是一種重要的翻譯后修飾，參與諸多生理和病理過程。目前，對于蛋白質的O-糖基化的研究進展仍非常緩慢，一個重要的原因就是缺乏高效的對O-糖基化蛋白進行分離和鑒定的技術。創新性地將點擊化學反應、二維電泳和質譜技術結合，對尋找細胞內0-糖基化蛋白進行了技術探索性研究。首先利用代謝性標記手段，在人肝癌細胞HCCLM6培養基中加入四乙?；B氮半乳糖胺（Ac4GaINAZ）對細胞內O-GalNAc糖基化蛋白進行標記：其次通過點擊化學將炔基熒光基團連接至標記的O-糖基化蛋白的疊氮基團；應用二維電泳技術對標記蛋白進行分離，并找到13個具有熒光信號的蛋白點；最后對具有熒光信號的蛋白進行質譜鑒定，成功鑒定到7種蛋白，經軟件預測后，GRP78蛋白和ANXA1蛋白均具有潛在的0-糖基化位點。這為尋找細胞或生物體中的O-糖基化蛋白奠定了基礎，并為高通量篩選O-糖基化蛋白提供技術平臺。

關鍵詞：O-糖基化蛋白；點擊化學；二維電泳；質譜技術

中圖分類號：Q599

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）05-0377-05

糖基化是一種常見的蛋白質翻譯后修飾，存在于生物體內超過一半的蛋白質中。糖基化修飾對于蛋白質的結構和功能具有顯著影響，參與調節信號傳導、分子轉運、細胞粘附、免疫應答等牛物學過程.除此之外，異常的糖基化修飾與諸多疾病有密切關系，粘蛋白型O-糖基化是一類廣泛仔在的蛋白質糖基化修飾，其合成的第一步為：UDP-乙酰氨基半乳糖（UDP-GalNAc：，供體）通過多肽N-乙酰氨基半乳糖基轉移酶（pp-GalNAc-Ts）的催化連接在蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基（受體）的羥基氧上。由于缺少保守的O-糖基化氨基酸特征序列，缺乏通用的糖苷酶以及O-糖鏈結構的復雜性等原因，目前對于蛋白質O-糖基化的分析仍處于方法開發階段。生物正交點擊化學（bioorthogonalClick chemistry）可經簡單的疊氮一炔基環化加成反應將含炔基檢測標簽共價連接到生物兼容的疊氮標記的待測分子上。憑借其生物相容性、生物正交性、高效性和高特異性等優點.此類新興技術在化學糖生物學領域發展迅速[10，11]?；诏B氮的生物正交點擊化學在糖生物學研究中的應用，主要分為以下幾個方面：1）在糖代謝過程中的應用。在糖代謝研究的早期.Reutler教授開發了代替唾液酸的非天然N-酰基類似物，為唾液酸的研究提供了新思路。近10年來.Bertozzi教授利用施陶丁格反應進行糖代謝的研究，進一步推動了生物正交點擊化學的發展：2）在糖鏈活體成像中的應用。目前，AC4ManNAz，AC4GalNAz和GDP-FucAz均成功地應用于糖鏈活體成像研究中；3）在糖鏈富集和糖組學中的應用。 NarimatsU教授將生物正交點擊化學與質譜技術結合，成功的鑒定出巖藻糖基化的N -聚糖位點圖譜。此外，本課題組開發的一種以二硫鍵和末端炔基修飾的二氧化硅納米顆粒，可從多肽混合體系中特異性地富集疊氮標記的多肽：4）在病毒研究中的應用?？捎茂B氮或炔基修飾病毒表面.有利于成像和藥物傳送；5）另外，生物正交點擊化學在蛋白活性表達譜，糖復合物合成以及糖芯片技術中也有廣泛的應用。

本研究利用疊氮標記的單糖類似物——Ac4GaINAz（圖1）對人肝癌細胞系HCCLM6進行代謝性標記，單糖類似物進入細胞內參與正常糖代謝過程.可使細胞內的O-糖基化蛋白標記上疊氮基團，再通過疊氮和炔基的點擊化學反應實現對蛋白的熒光標記，最后，利用二維電泳技術將蛋白進行分離以及MALDI—T0F質譜對蛋白進行鑒定（實驗流程見圖2）。本研究為尋找O一糖基化蛋白建立了良好的技術平臺，為蛋白質O-糖基化的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人肝癌細胞系HCCLM6南人類基因組南方研究中心張新教授惠贈。

1.1.2 相關試劑

胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）購白美國GIBCO公司；胰蛋白酶消化液（Try psin）和AlexaFluor 555熒光試劑（炔基熒光試劑，Alkynyl fluophor）購自美國Life technology公司；細胞裂解液成分為：1% NP-40，50 mmoUL Tris-HCL 150 mmoI/lNaCl， 0.1% SDS，Cocktail；細胞培養基DMFM/HICJH GLUCOSE、BCA定量試劑盒和蛋白 Marker購白美國Thermo公司；四乙?；B氮半乳糖胺（AC4GalNAz）由本實驗室工勝老師合成；CuSO4、NaVc購自國藥集團化學試劑有限公司；IPG膠條、兩性電解質Bio-Lyte和礦物油購白美國Bio-Rad公司；TBTA、DTT和IAA購自美國Sigma公司；配制水化液所用試劑、平衡緩沖液所用試劑、12.5%丙烯酰胺凝膠所用試劑均為進口或國產分析純試劑；水化上樣緩沖液成分：水化液，DTT和Bio-Lyle；平衡緩沖液I成分：平衡液，DTT和溴酚藍；平衡緩沖液Ⅱ成分：平衡液，IAA和溴酚藍、

1.1.3 儀器

等電聚焦儀和垂直電泳儀（美國Bio- Rad公司）。熒光化學發光及同位素影像掃描分析儀（fluorescent and radioisotope science imaging sys-tems，，FLA-5100，日本Fujifilm公司）；平板掃描儀（臺灣UMAX公司）；MALDI-TOF質譜儀（Ultrallex

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞標記

HCCLM6細胞培養于37℃，5% C02培養箱，DMEM（含 10% FBS）培養基，待細胞生長進入指數生長期；取50 μL濃度為10 mmol/L的AC4Gal-NAz加到培養皿底部，待溶劑乙醇揮發，將Sxl06個細胞鋪于培養皿中，使標記終濃度為100μmol/L；培養細胞48h。

1 .2.2 蛋白樣品的獲得

細胞標記48h后，吸掉培養基并進行胰蛋白酶消化，將細胞轉移至離心管中，800 r/min離心收集細胞；加入150 μL細胞裂解液震蕩裂解，12 000g離心30min，保留上清；BCA蛋門定量試劑盒進行蛋白定量。

1.2.3 疊氮一炔基環化加成反應

定量后取300 μg總蛋白，加入1.5 μL AlexaFluor 555熒光試劑和2μL催化劑，并用PBS（pH 7.8）補齊至400μL，置于恒溫震蕩儀中25℃反應1 h；反應結束后，甲醇氯仿法進行蛋白沉淀：樣品中加入1.2 mL甲醇并混勻，加入300 μL氯仿并混勻，加入800 μL超純水并混勻，15 000 g離心5 min棄上清，加入900 μL甲醇后15 000 g離心5 min，棄上清，空氣中風干蛋白沉淀。

1.2.4 等電聚焦

用水化上樣緩沖液將樣品定容至300 μL；IPG預制膠條室溫放置5 min；沿電泳槽邊緣連續加入樣品.不要產生氣泡；去除預制IPG膠條上的保護層，將IPG膠條置于樣品中；膠條上覆蓋1 mL礦物油：進行等電聚焦電泳。

等電聚焦電泳儀參數沒置：溶脹上樣階段：

50 V

12 h等電聚焦階段：

200 V

1h

快速升壓

500 V

1h

快速升壓

1 000 V

2h

慢速升壓

10 000 V

2h

慢速升壓

10 000 V 80 000 Vhrs 快速升壓

500 V

Hold

快速升壓

1.2.5 SDS-PAGE電泳

等電聚焦結束后，瀝干膠條上的礦物油，置于平衡緩沖液I中平衡I5 min；平衡緩沖液Ⅱ中平衡15 min；去離子水清洗殘余的緩沖液，進行SDS-PAGE電泳。

電泳儀參數設置：階段I：16 mA/gel 30 min階段Ⅱ：24 mA/gel 6 h

1.2.6

熒光掃描與考馬斯亮藍染色

對凝膠進行熒光掃描，采集熒光信號，獲得熒光信號二維電泳圖；對平行凝膠進行考馬斯亮藍染色，脫色后掃描獲得二維電泳圖譜。

1.2.7 MALDI-TOF質譜

比對熒光信號二維電泳圖譜結果與考馬斯亮藍染色結果，對具有熒光信號的蛋白進行收集；進行質譜分析。

2 結果與分析

2.1 熒光信號二維電泳圖譜

利用熒光化學發光及同位素影像掃描分析儀對二維電泳凝膠進行熒光信號掃描。結果如圖3所示。結果顯示，熒光信號大部分出現在pH堿性端，相對分子質量40 kD附近；少部分信號出現在pH酸性，相對分子質量15 kD附近。

2.2 二維電泳圖譜

熒光信號掃描以后，對同一塊二維電泳凝膠進行考馬斯亮藍（CBB）染色，脫色后用平板掃描儀進行掃描。結果如圖4所示。

2.3 質譜鑒定結果

對熒光信號二維電泳圖譜和考馬斯亮藍染色圖譜進行比對，尋找到13個具有熒光信號的蛋白點（如圖4所示）。對其進行割膠和質譜鑒定，成功鑒定到7種蛋白，如表1所示。我們用Net0-Glyc 3.1 Server軟件對7種蛋白的O-糖基化位點進行預測，其中GRP78蛋白和ANXA1蛋白分別具有2個和1個潛在的O-糖基化位點。

3 結論與討論

點擊化學具有生物相容性、高特異性等優點，已逐步發展為極有價值的化學生物學研究方法。尤其是在糖生物學領域，點擊化學技術在高通量糖蛋白質組學和疾病相關標志物尋找等方面發揮了重要作用，疊氮試劑因其生物學惰性，在體外實驗和體內實驗（例如，小鼠和斑馬魚）中均有很大突破，應用也最為廣泛。靈敏的選擇性和生物相容性使生物正交點擊化學為糖生物學研究帶來了巨大變革，基于生物正交性點擊化學的糖生物學研究主要包括四個方面：1）利用疊氮的反應活性和特異性，作為捕獲底物的工具；2）用于新型生物正交性官能團的發現；3）在高通量蛋白質組學中的應用；4）對疾病發生發展機制的研究。目前，對于O-糖基化蛋白的發現依然基于凝集素富集技術，受限于凝集素特異性和靈敏度較差等缺點，尤其是在研究復雜糖鏈的過程中，這種技術思路存在較大的局限性。為建立高通量的尋找O-糖基化蛋白的技術，本研究將二維電泳技術與點擊化學技術相結合，并對利用糖探針標記所發現的潛在的0—糖基化蛋白進行了質譜鑒定，所發現的部分蛋白經糖基化預測軟件分析發現其預測含有O-糖基化修飾位點。雖然目前的技術無法判定確定的糖基化修飾位點，但是本研究仍為O-糖基化蛋白的高通量發現提供了有效的技術策略。今后通過改善和優化標記糖蛋白的富集效率、總蛋白的分級分離能力等，將能進一步提升熒光信號的靈敏度與O-糖蛋白的展現特異性，從而更加完善該技術。