表達綠色熒光蛋白的布魯氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬細胞過程的差異分析

馬 慧 茍亞峰 劉鵬濤 高劍峰

摘要：通過布魯氏菌（BrUcella） 16M（強毒株）和M5（弱毒株）進入小鼠巨噬細胞后產生的熒光強度，結合布魯氏菌胞內生存能力分析二者侵染小鼠巨噬細胞過程的差異，為布魯氏菌在細胞內的生存繁殖及其分子機制研究提供理論依據(jù)。將綠色熒光蛋白（green fluoreseent prolein. GFP）布魯氏菌16M（強毒株）和M5 f弱毒株）分不同時間段侵染小鼠巨噬細胞（感染復數(shù)為100：1），通過胞內生存實驗、激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀觀察和檢測布魯氏菌侵入RAW 264.7過程的差異 結果表明，布魯氏菌16M和M5和GFP的l6M和M5侵染RAW264.7的能力不受影響，通過流式細胞儀可以鑒別CFP布魯氏菌，但是不能確定細菌的存活狀。 結合布魯氏菌16M和M5胞內生存能力分析發(fā)現(xiàn)CFP+細胞的增加與活菌培養(yǎng)計數(shù)法（colony forming unit，CGU）數(shù)量的減少存在一一對應的關系，并且在侵染初期（5～25 min） 16M與M5的熒光強度并沒有顯著差異。 結果提示，布魯氏茵16M和M5在侵染進入宿主細胞的初期即侵襲能力并沒有明顯差異.認為造成毒力差異的主要原因是兩者的繁殖能力。

關鍵詞：布魯氏菌；綠色熒光蛋白（CFP）；小鼠巨噬細胞；激光共聚焦顯微鏡：流式細胞儀

中圖分類號：Q38

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）05-0401-06

布魯氏菌屬于革蘭氏陰性胞內菌，可以對人類和家畜造成嚴重的慢性感染。人若患有此病會經(jīng)常發(fā)高燒.精神萎靡，嗜睡，關節(jié)炎和脾腫大。在反芻動物中，布魯氏菌病可導致流產，造成巨大的經(jīng)濟損失。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌沒有典型的外毒素、Ⅲ型分泌系統(tǒng)等毒力元件，其毒力主要表現(xiàn)在侵襲力和繁殖力。作為胞內寄生菌.它們既能在小鼠巨噬細胞生存，也能在非巨噬細胞（如滋養(yǎng)層細胞，上表皮細胞等）中生存，并且可以引起天然宿主網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)持續(xù)性感染。因此了解布魯氏菌在細胞內的生存繁殖及其分子機制是理解布魯氏菌致病性的關鍵。布魯氏菌強毒株16M和疫苗株M5是兩種典型胞內寄生菌，同屬布魯氏菌I型標準菌株，進入宿主后，能以不同方式逃避巨噬細胞的殺滅并在細胞內生存、繁殖，還能逃避體液免疫和抗生素的殺滅作用，使巨噬細胞反而成為庇護所，導致臨床治療困難。但就日前來說，對布魯氏菌進入宿主胞內和繁殖機制還有很多未知。因此，通過含有GFP的載體pMC-221電轉進入布魯氏菌16M和M5，利用GFP布魯氏菌侵染RAW 264.7進行流式細胞和胞內生存能力分析，對布魯氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬細胞過程的侵襲力和繁殖力比較，分析導致兩者毒力差異的主要因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種、細胞系和載體

布魯氏菌標準強毒株16M和弱毒株M5、RAW 264.7系由新疆石河子大學人畜共患病實驗室保存。載體pMC-221由美國威斯康星大學Jerome S.Harms博士惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器

布魯氏菌液體和固體培養(yǎng)基均購白美國BD公司； DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司：丙三醇、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、過氧化氫均為國產試劑；PCR儀（Techne、Bl0 -RAD、Biometra）； UV凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）；超速離心機（Eppenclorf， centrifuge -5415D）；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162）；恒溫搖床（7HWY-2102C），高速冷凍離心機（Sigma，2-16K）；常溫離心機（Beickmanmi-crofuge16、Thermo PC21）；水浴鍋（DKB-501A）；全自動高壓蒸汽滅菌罐；超低溫冰箱；電泳儀：超凈工作臺；去離子水儀器（Thermo）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162型、EYELA SLI～700）；電轉儀（Eppen-dorr eporator）；電擊杯（eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌16M和M5的培養(yǎng)

將布魯氏菌16M和M5接種到布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，封口置于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取單菌落置于20 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，置于37℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3～4d。

1.2.2 布魯氏菌16M和M5電轉化感受態(tài)細胞的制備

挑取布魯氏菌16M和M5單菌落.分別至20 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；轉接50 μL菌液至100 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～18 h，取94μl_的菌液至無菌EP管中，取出布魯氏菌16M和M5的菌液冰上放置30 min，期間搖動幾次，保證冷卻均勻；4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，收菌；用20 mL預冷的去離子水重懸浮菌體，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，倒掉上清；重復卜一步3次；加入預冷的15 %甘油，加入的量為濃縮60～80倍；重懸菌體，分裝，每管100 μL，置于-80℃保存。

1.2.3 電擊轉化

取pMC-221質粒f41（圖1）9μL加入布魯氏菌感受態(tài)細胞中，吹打混勻，冰上靜置15 min，轉移至l mm電擊杯中，電擊參數(shù)為1.8 kV/mm， 4.5 ms，1次脈沖。電擊完成后立即加入37℃預熱的900 μL的布魯氏菌液體培養(yǎng)基，吹打均勻，轉移到1.5 mLEP管中，封口膜封口，置于37 ℃， 180 r/min培養(yǎng)24 h。常溫8 000 r/min離心2 min收菌，重懸菌體，涂布于氯霉素抗性的布魯氏菌同體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，挑出單菌落。挑取單菌落至含有1mL的布魯氏菌液體培養(yǎng)基的EP管中，置于37℃ 、180 r/min振蕩培養(yǎng)24h。取100μL菌液至1 mL的EP管中85 ℃金屬浴滅活1 h。菌液PCR鑒定陽性克降菌。

1.2.4 巨噬細胞系RAW264.7培養(yǎng)和細胞計數(shù)

無菌條件下將細胞瓶內小鼠巨噬細胞經(jīng)2.5%胰酶消化后，轉移至6孔板中，孔內細胞培養(yǎng)液加至4mL，放人細胞培養(yǎng)箱，5% C02、37℃，24 h半量換液，培養(yǎng)2 d，備用。取六孔板中1孔，用300 μL 2.5%胰酶消化2 min，加1 mL培養(yǎng)液，用吸管吹打至完傘脫落，收集至1.5 mL離心管，2 000r/min離心2min，棄上清，加入lmL PBS，取10 μL至另一含90 μL PBS的1.5 mL離心管，稀釋混勻，取10μL懸液滴在計數(shù)板上，細胞計數(shù)。1.2.5 布魯氏茵16M和M5侵染小鼠巨噬細胞和菌液計數(shù)

取lμL經(jīng)計數(shù)的菌液于50 mL離心管中，3 min 12 000 r/min，PBS洗3次，然后加19 mL無雙抗、含10%胎牛血清的新鮮細胞培養(yǎng)液，重懸。按照布魯氏菌與RAW 264.7的比例為100：1，麥氏比濁至所需濃度，稀釋至1 mL重懸細菌液。棄去六孔板中舊完全培養(yǎng)基，加入重懸細菌液，放入細胞培養(yǎng)箱，5%CO2、37 ℃條件下分別培養(yǎng)5、10、20、30 min、I、1.5、2、2.5、6、12、24、48 h取出六孔板，PBS洗3遍，加入2 mL含20/c雙抗、10%胎牛血清的新鮮細胞培養(yǎng)液，備用。

1.2.6 布魯氏菌16M和M5的胞內存活實驗

RAW 264.7傳代至六孔板，分別編為16M組、M5組、GFP-16M組、CFP-M5組。培養(yǎng)至鋪滿六孔板底部，細胞計數(shù)。將布魯氏菌16M和M5接種到20 mL的布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，180r/min，37℃恒溫搖床培養(yǎng)至對數(shù)期。收菌，PBS反復重懸浮菌體。依照1.2.5步驟計算出的細胞與細菌比例

將布魯氏菌加入到六孔板中，置于CO2濃度為5.0，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。侵染l h之后六孔板中每孔加入2.5μL慶大霉素作用45 min，儀染4、8、12 h之后的小鼠巨噬細胞用PBS清洗3次，每次5 min；收集細胞接種密度為lxl0個，之后加入0.2%細胞裂解液lmL，用移液器將RAW264.7完全吹打混勻，釋放出胞內菌。然后轉移至1.5 mL的EP管中，冰浴處理5 min；然后按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋，移液器吹打均勻，然后每個梯度取100μL，均勻涂布至無抗性的布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，3～4 d，記錄平皿中細菌的數(shù)量，每組實驗重復3次。

1.2.7 布魯氏菌16M和M5侵染RAW 264.7的激光共聚焦顯微鏡試驗

將RAW 264.7傳代至六孔板（蓋玻片置于每孔中），分別編為Brucella組和過氧化氫Brucella組（蓋玻片以備置于每孔中）每孔3 mL，放入細胞培養(yǎng)箱，5% C02、37℃條件下過夜培養(yǎng)（激光共聚焦顯微鏡試驗中平鋪在六孔板的數(shù)量最好維持在（1～lO）xl0 5/mL為最佳，細胞數(shù)量較多，平鋪在6孔板中形成層疊，造成熒光重疊，對熒光觀測有一定影響）。次日在六孔板中將已爬好細胞玻片用PBS浸洗3次，加入無雙抗的培養(yǎng)液，備用；取1 mL經(jīng)麥氏比濁法稀釋的菌液加入每孔中，侵染時間分別為4 h：侵染完成后在過氧化氫Brucella組中加入過氧化氫.取出細胞爬片蓋向滴有70%甘油的載玻片上，制片完成放入保濕盒，用于共聚焦顯微鏡觀測.每組實驗重復3次。

1.2.8 羊布魯氏菌16M和M5侵染RAW 264.7的流式細胞儀試驗

將RAW 264.7加入六孔板，放人細胞培養(yǎng)箱，5%CO2、37℃條件下過夜培養(yǎng)。次日取l mL經(jīng)麥氏比濁法稀釋的菌液加入每孔中，侵染時間分別為5 .10、15、20、25 min、6、12、24、48 h，根據(jù)侵染時問依次加入PBS吹打細胞收集放入1.5 mLEP管中，離心3min 12 000 r/min，去除PBS加入4%多聚甲醛和慶大霉素2.5μL吹打混勻，靜止30 min，在侵染1 h后加入2.5μL，慶大霉素為了防止殘留在胞外的細菌侵染細胞影響實驗結果。之后用于流式細胞儀分析試驗，每組實驗重復3次，

2 結果

2.1 布魯氏菌侵染之前RAW 264.7和茵量的計數(shù)結果

根據(jù)細胞計數(shù)方法得到細胞lxlO11/mL.按照細菌與細胞的MOI為100：1別需要細菌lxlO 8。利用麥氏比濁管將布魯氏菌比濁稀釋至1×lO8/mL。

2.2 布魯氏菌侵染RAW 264.7激光共聚焦顯微鏡試驗結果

按照圖2A中顯示結果來看，布魯氏菌侵染進入RAW 264.7后產生CFP綠色熒光蛋白，未進入胞內的布魯氏菌在胞外不產生綠色熒光。圖2B結果顯示來看，加入過氧化氫的目的是使小鼠巨噬細胞破裂死亡并殺死胞內布魯氏菌，但是發(fā)現(xiàn)GFP沒有因為RAW 264.7破裂被釋放和伴隨著布魯氏菌的死亡而熒光強度受到影響。2.3 16M和M5侵染小鼠小鼠巨噬細胞的胞內生存能力實驗結果

布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞0～12 h的胞內菌CFU計數(shù).從圖3A、B可以看出，CFP布魯氏菌16M和M5對比正常布魯氏菌16M和M5在胞內生仔能力方面并沒有影響。因此，GFP基因的整合重組并不會影響布魯氏菌本身的生物特性。

2.4 16M和M5侵染小鼠巨噬細胞0—48 h流式細胞儀檢測

圖4A中結果得知含有GFP的布魯氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬細胞264.7在6—24 h內GFP+細胞百分數(shù)增長迅速，證明是細胞免疫強烈階段、 24～48 h增長趨于平緩。圖4B中我們可以看出在0—24 h之問CFU數(shù)量減少，24～48 h后逐漸增加。圖3A、B結合分析發(fā)現(xiàn)GFP+細胞百分數(shù)與CFU數(shù)量在0～48 h之問有一一對應關系，圖3A實驗結果可以得出流式細胞儀通過GFP+細胞的百分數(shù)，反映含有GFP布魯氏菌16M和M5進入小鼠巨噬細胞264.7的數(shù)量，但不能確定GFP布魯氏菌進入宿主細胞后的存活狀態(tài)，但通過胞內菌CFU計數(shù)，可以很好地彌補這一點。

2.5 16M和M5侵染初期小鼠巨噬細胞5—25min流式細胞儀檢測

圖5表示細菌侵染細胞的初級階段，5 min時GFP+細胞數(shù)量少且可忽略不計，10 min時GFP+細胞逐漸增多但布魯氏菌16M和M5之間的差異并不明顯，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異（P>0.05），得知在侵染初期（5～25 min之內）布魯氏菌16M和M5進入小鼠巨噬細胞的數(shù)量大致相同。

3 討論

布魯氏菌16M和M5雖同為I型布魯氏菌，但至今對其致病機制沒有更為深入的研究，目前，國內外主要集中在布魯氏菌毒力因子和宿主因子的篩選及功能研究上，缺乏對布魯氏菌16M和M5侵入、胞內存活、復制等過程的認識和差異比較。因此，本實驗利用流式細胞儀對熒光的高敏感性，將含有GFP的布魯氏菌16M和M5劃分不同時間段侵染RAW 264.7得到的結果進行差異比較，經(jīng)研究證實含有GFP的布魯氏菌與不含有GFP的布魯氏菌在侵染細胞和進入宿主細胞后生仔及繁殖能力上相同，因此用含有GFP的布魯氏菌來侵染小鼠巨噬細胞不會干擾實驗結果。從實驗結果中我們得知0～24 h布魯氏菌侵染細胞使得GFP+細胞百分數(shù)增長迅速，之后便達到飽和狀態(tài)，增長緩慢；但通過CFU計數(shù)得知0—24 h布魯氏菌16M和M5在胞內存活數(shù)量下降了15倍之多，說明大部分布魯氏菌并沒有逃脫內吞作用 24—48 h后細菌在胞內繁殖使得數(shù)量增加，但胞內布魯氏菌16M與M5的數(shù)量差距也在不斷增大。之后通過流式細胞儀測定儀染初期5—25 min時發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌16M和M5進入細胞的數(shù)量差距并不明顯，反映出布魯氏菌16M與M5進入細胞的侵入能力相同但胞內存活和復制的能力16M強于M5，因此認為二者產生差異的原因豐要是與胞內存活與復制有關。