利用RAPD分子標記對30份山茶屬種質資源進行分類分析

晏嫦妤 黃華林 李家賢 何玉媚

摘要 [目的]對30份山茶屬種質資源進行分類分析。[方法]利用RAPD分子標記技術研究30份山茶屬種質資源的遺傳多樣性，并進行分類分析。[結果]17個RAPD引物共擴增出138條帶，多態性條帶為129條，多態性比率為93.5%，材料間的遺傳相似系數（GS）變化范圍為0.605～0.855。[結論]利用NTSYS軟件對RAPD擴增結果進行聚類分析，可將30份資源分為5大類群，其分類結果與張宏達分類體系基本一致。

關鍵詞 山茶屬種質資源；RAPD；分類

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-04962-02

山茶屬（Genus Camellia）是山茶科（Theaceae）中最大、系統上較原始的一個屬。我國是該屬植物的分布中心，擁有絕大多數的種類，無論對于亞屬（Subgenus）、組（Section）還是種（Species）的劃分，山茶屬植物在分類學上都爭議較大。Sealy[1]、張宏達[2]以及閔天祿[3]在各自的研究基礎上提出了世界著名的3大山茶屬分類系統，但是這3大分類系統之間存在巨大分歧。因此，關于山茶屬資源的分類研究仍是研究者關注的熱點。隨著分子生物學的不斷發展，從DNA分子水平揭示植物系統演化關系，使植物系統學研究進入了一個新的時代。筆者根據張宏達分類體系中的分類選擇了山茶屬中2個亞屬的5個組的資源，應用RAPD分子標記技術對其進行分類分析，旨在對現存分類學的結果進行初步的驗證，并為解決山茶屬分類分歧問題提供新的證據。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗材料均采自廣東省油茶種質資源圃（英德），采集新鮮枝條，帶回實驗室取一芽二葉葉片，用液氮處理后置于-80 ℃冰箱冷凍保存備用。采集的種質資源的名稱及原產地見表1。

1.2 基因組DNA的提取 采用CTAB法[4]從供試材料中提取基因組DNA，經質量檢測后，稀釋至200 ng/μl，于-20 ℃保存，用于后續的RAPD分析。

1.3 RAPD擴增 RAPD引物采用40個隨機引物，篩選出擴增多態性條帶多，穩定性強，背景清晰的引物17條（表2）。RAPDPCR反應體系為25 μl，包括，模板DNA 50 ng，引物0.5 μl，2×PCR mix（含Taq酶，dNTP，Mg2+等）12.5 μl，用ddH2O補充至25 μl。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性50 s，37 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。RAPDPCR產物在1.6%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果用自動凝膠成像系統拍照分析。

1.4 數據分析 將電泳圖譜清晰且可重復的 DNA 條帶記為1，同一位置上的弱帶且不重復或未出現條帶的記為0，形成“1，0”原始數據矩陣，利用 NTSYSpc（2.10）數據分析軟件進行數據分析，采用 UPGMA 方法構建聚類圖。

2 結果與分析

2.1 30份山茶屬種質資源的多態性分析 使用17個隨機引物對30個供試材料進行擴增，共擴增出138個位點，其中多態性條帶為129條，占總條帶數的93.5%，每個引物平均獲得7.6條多態性條帶（圖1）。

2.2 30份山茶屬種質資源的聚類結果分析 利用 NTSYSpc（2.10）數據分析軟件，用UPGMA 法建立了30份山茶屬種質資源間的遺傳關系RAPD聚類分析圖（圖2）。RAPD聚類分析結果表明，30份種質資源間的相似系數在0.605～0.855，當相似系數為0.665時可將30份種質資源劃分為5大類群。第1類只有1份資源——金花茶（樣品號：30）。第2類也只有1份資源——張氏紅山茶（樣品號：29）。第3類包括包含2份資源：新興紅花油茶（樣品號：3）和廣寧紅花油茶（樣品號：6）。第4類包含3份資源：香花糙果茶（樣品號：1）、青皮糙果茶（樣品號：9）和紅皮糙果茶（樣品號：10）。第5類包括23份資源，可分為2個亞類：第1亞類包括軟枝油茶3#（樣品號：2）等9份資源，第2亞類包括廣寧白花油茶（樣品號：12）等14份資源。

山茶屬植物是異花授粉植物，遺傳組成上的高度雜合和表現形上的多態性給植物分類帶來了困難，這也是山茶屬植物分類至今未能定論的主要原因。DNA分子標記是DNA序列信息的直接或間接反應，為植物系統學的研究提供了大量的信息數據，DNA分子標記的分類結果能夠對現存的分類學結果進行驗證，并可能提出新的見解，做出合理的修訂。

通過對比發現，試驗中RAPD分子標記與張宏達分類體系中對不同組的劃分基本一致，但稍有區別。根據張紅達分類體系可知，30份供試資源分屬于2個亞屬5個組，其中22份資源屬于山茶亞屬油茶組，窄葉短柱茶屬于山茶亞屬短柱茶組，金花茶屬于茶亞屬金花茶組，張氏紅山茶、廣寧紅花油茶和新興紅花油茶屬于山茶亞屬紅山茶組，青皮糙果茶、紅皮糙果茶和香花糙果茶屬于山茶亞屬糙果茶組。從RAPD聚類分析結果看，22份油茶組資源和窄葉短柱茶聚為一類，說明這2個組的親緣關系較近，支持了閔天祿對油茶組和短柱茶組合并的觀點[5]。紅山茶組的3份資源，廣寧紅花油茶和新興紅花油茶聚為一類，而張氏紅山茶未與這2份資源聚在一起，分析可能的原因為：在張宏達分類體系中是根據其花色等生物學性狀進行分類的，但張氏紅山茶具有四季開花特性，屬多季開花植物，其生理特性與其他2份資源有差異，因此在DNA水平上張氏紅山茶與廣寧紅花油茶和新興紅花油茶可能存在較大差異；糙果茶組的3份資源聚為一類，金花茶單獨為一類，這2組的劃分與張宏達分類體系中的分類一致。據鄧白羅[6]等研究表明，RAPD分析結果基本上支持張宏達的山茶屬紅山茶組植物分類方法，說明形態上的相似性與DNA的相似性有很強的相關性，試驗結果也表明，RAPD的分類結果與張宏達分類體系較為一致，但也存在部分差異。因此，利用分子標記方法，并與傳統分類方法進行相互驗證，將使山茶屬植物的分類系統趨于更加科學合理化。

參考文獻

[1] SEALY J R.A revision of the genus Camellia[M].London：the Royal Horticulture Society，1958.

[2] 張宏達，任善湘.中國植物志，第49卷，第3分冊[M].北京：科學出版社，1998.

[3] 閔天祿.世界山茶屬的研究[M].昆明：云南科技出版社，2000.

[4] 黃建安，黃意歡，羅軍武，等.茶樹基因組DNA的高效提取方法[J].湖南農業大學學報，2003，29（5）：402-407.

[5] 閔天祿.山茶屬山茶組植物的分類.分化和分布[J].云南植物研究，1998，20（2）：127-148.

[6] 鄧白羅，譚曉風，漆龍霖，等.山茶屬紅山茶組植物的RAPD分析及分類研究[J].林業科學，2006，42（5）：36-40.安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：4969-4970，4973

責任編輯 石金友 責任校對 李巖