食品和飼料中轉基因植物FMV35S啟動子環介導等溫擴增檢測方法的建立

鄺筱珊 胡松楠 游淑珠等

摘要 [目的]建立FMV35S基因啟動子環介導等溫擴增的檢測方法。[方法]建立一種檢測食品和飼料中FMV35S轉基因成分的環介導恒溫擴增（LAMP）檢測方法，并利用實時濁度法對該LAMP檢測方法進行靈敏度、特異性和穩定性評價。[結果]該方法的檢測限為0.5%，特異性和穩定性良好。采用LAMP法與熒光PCR方法進行了實際樣品對比檢測，結果一致可靠。[結論]可采用LAMP法對食品和飼料中FMV35S轉基因成分進行檢測。

關鍵詞 食品；飼料；FMV35S基因；環介導恒溫擴增；檢測

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-04999-03

截止到2012年，轉基因作物的種植面積已經連續增長17年，達到了420 000 000 hm2[1]。新型轉基因生物不斷涌現的同時，有關轉基因作物在食品安全性、環境保護和倫理方面的爭論一直愈演愈烈。為了滿足消費者的知情權和國際貿易的要求，越來越多的國家和地區要求對轉基因食品進行標示。不同的國家和地區也相應的發布了檢測方法和判定標準。我國也于2002年7月開始實施《轉基因食品衛生管理條例》，對轉基因食品產品進行標識管理。

熒光PCR法是經典的轉基因檢測方法，同時也是目前采用較多的一種檢測方法。近年來，越來越多的人將目光投向了非PCR檢測方法的研究，比如基于蛋白質的ELISA、免疫層析試紙條方法；還有基于核酸的熒光交叉相關光譜法[2]、基于生物條形碼的電化學發光法[3]、基因芯片法[4]等。

環介導等溫擴增（LAMP）是一種新的、非PCR的核酸檢測方法[5]，最少可利用4條引物，在Bst DNA poLymerase作用下檢測目的基因片段。LAMP反應有以下幾個優點：不需要復雜的儀器裝置，僅靠水浴鍋或等溫孵育裝置即可達到反應要求；擴增產物肉眼可辨，不需要檢測裝置即可快速準確的判斷；、LAMP檢測反應時間短，1 h內可出具檢測結果。基于以上優點，近些年LAMP已經廣泛應用于病毒、食源性微生物、轉基因和肉類鑒定方面[6-10]。

玄參花葉病毒35S啟動子（Figwort Mosaic Virus promoter）FMV35S基因是植物遺傳操作常用標記基因，很多轉基因植物（如MON89034，RT73等）都含有FMV35S基因，是檢測轉基因生物的重要指標。筆者建立一種檢測食品和飼料中FMV35S轉基因成分的LAMP方法，為轉基因的檢測擴增提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。豇豆、四季豆、大豆、玉米、花生、白云豆、豌豆、燕麥、蕎麥、馬鈴薯、扁豆、番茄、核桃、大杏仁、綠豆、蠶豆、轉基因油菜RT73、轉基因水稻KMD、轉基因小麥B73.6.1、轉基因大豆DP305423、轉基因大豆A5547.127、轉基因大豆GTS40.3.2、轉基因玉米MON89034、轉基因玉米MIR604、轉基因玉米EVENT98140、轉基因玉米BT176和轉基因玉米MON810，均由實驗室提供。

1.1.2 主要儀器。PICO17高速臺式離心機，購自Thermo Fisher Scientific公司；LA.320CLAMP實時濁度儀，購自日本榮研化學株式會社。

1.1.3 主要試劑。Bst DNA 聚合酶，購自New England Biolabs（NEB）公司；甜菜堿（Betaine）和MgCl2，購自Sigma公司；dNTPs，購自寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Green I 熒光染料，購自廈門致善生物科技有限公司；LAMP引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成；其他試劑均為國產分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取。將樣品置于粉碎機中均質碾磨成粉末狀，植物樣品基因組DNA提取采用CTAB法[11]。DNA提取完畢后，利用Thermo Fisher Nanodorp 測定核酸含量和質量。當OD260/OD280比值在1.7～1.9時，濃度50～100 ng/μl適宜于LAMP檢測。

1.2.2 LAMP檢測體系和反應條件。LAMP反應體系總體積為25 μl，其成分包括：FIP和BIP各1.6 μmol/L，F3和B3各0.2 μmol/L，20 mmol/L Tris.HCl（pH8.8），10 mmol/L KCl，8 mmol/L MgSO4，10 mmol/L （NH4）2SO4，0.1% Tween20，1 mol/L甜菜堿，1.6 mmol/L dNTP，8 U Bst大片斷DNA聚合酶，2 μl DNA（50～100 ng/μl）。參照LAMP濁度儀使用說明，將混合物置于反應孔中，于63 ℃恒溫反應60 min，最后于80 ℃下保溫5 min以結束反應。

1.2.3 LAMP檢測法檢測FMV35S基因引物序列。通過GENEBANK下載FMV35S啟動子序列，使用在線設計軟件Primer Explorer version 4 （http：//primerexplorer.jp/e）和LAMP Designer軟件設計特異引物FMV.4。

1.2.4 FMV35S基因LAMP檢測法靈敏度試驗。用均質的100%轉基因玉米MON89034粉與均質非轉基因大豆粉按比例配置成20%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%（W/W）的標準樣品，每個稀釋度分別提取基因組DNA進行LAMP試驗，以ddH2O代替DNA模板作為陰性對照，以FMV.4作為LAMP引物，100%轉基因玉米MON89034作為陽性對照，63 ℃運行60 min以確定LAMP反應的靈敏度。

1.2.5 FMV35S基因LAMP檢測法特異性試驗。用轉基因油菜RT73、豇豆、四季豆、大豆、玉米、花生、白云豆、豌豆、燕麥、蕎麥、馬鈴薯、扁豆、番茄、核桃、大杏仁、綠豆、蠶豆、轉基因水稻KMD、轉基因小麥B73-6-1轉基因大豆DP305423、A5547-127、GTS40-3-2、轉基因玉米MON89034、MIR604、EVENT98140、BT176、MON810的DNA作為LAMP反應的模板，用FMV-4作為LAMP引物進行反應，63 ℃反應60 min，驗證LAMP反應的特異性，利用LAMP濁度儀觀察反應結果。

1.2.6 FMV35S基因LAMP檢測法穩定性試驗。利用建立的LAMP檢測法，分別對3個不同濃度（空白樣品0%和添加水平0.5%、1%的MON89034陽性模擬樣品）及MON89034標準品進行檢測，每個樣品重復20次，驗證LAMP反應的穩定性，反應結束后向反應管加入SYBR Green I觀察顏色變化，沒有擴增產物的陰性管呈橙色，有擴增產物的陽性管為綠色。利用LAMP濁度儀和肉眼直接觀察反應結果。

1.2.7 FMV35S基因LAMP檢測法的應用。采用試驗方法對市售的食品和飼料等20份樣進行LAMP 檢測。采用熒光 PCR法驗證檢測結果，熒光 PCR 檢測所用引物探針參考檢驗檢疫行業標準SN/T 1204-2003。

2 結果與分析

2.1 FMV35S基因LAMP檢測法的特異性評價 以27種不同植物DNA作為LAMP反應的模板，用試驗設計的FMV.4引物作為LAMP引物，進行LAMP檢測。圖1表明，FMV.4引物只對含有FMV35S啟動子的模板（MON89034，轉基因油菜RT73）特異性檢出，對其他不含FMV35S啟動子的轉基因品系和非轉基因物種均無擴增，未出現假陰性或假陽性結果，表現出良好的特異性。

2.2 LAMP靈敏度測定 圖2表明，LAMP實時濁度法結果顯示，不同濃度陽性模擬樣品的出峰時間和樣品濃度呈明顯梯度變化，LAMP實時濁度法檢測靈敏度可達0.5%。最低檢出限0.5%出峰時間約41 min，可以將反應時間確定為60 min。

2.3 LAMP穩定性評價 采用以FMV4為引物，對3種不同濃度樣品進行LAMP檢測，每種樣品重復20次。由表2可知，1%、0.5%及陰性樣品穩定性試驗結果與預期一致，顯示該方法重復性和穩定性良好。

2.4 應用LAMP法檢測食品中FMV35S轉基因成分 對市售燕麥片、小麥粉玉米球和菜籽粕20份食品和飼料樣品分別采用LAMP顯色法和實時熒光PCR法進行對比檢測。由表3可知，2種方法檢測結果一致，表明可以采用LAMP法檢測食品和飼料中FMV35S轉基因成分。

3 結論與討論

生物技術的不斷發展使新轉基因植物的種類在不斷增加。圍繞轉基因植物的爭議也是層出不窮。建立簡單、快速，成本低廉的檢測方法能夠更好保證相關貿易的順利進行，也可以更加高效的阻止非法轉基因植物流入我國。 注：1為轉基因玉米MON89034，2為四季豆，3為大豆，4為玉米，5為花生，6為白云豆，7為豌豆，8為燕麥，9為蕎麥，10為馬鈴薯，11為扁豆，12為番茄，13為核桃，14為大杏仁，15為綠豆，16為蠶豆，17為轉基因水稻KMD，18為轉基因大豆DP305423，19為基因大豆DP305423，20為轉基因油菜RT73，21為轉基因大豆GTS-40-3-2，22為豇豆，23為轉基因玉米MIR604，24為轉基因玉米EVENT98140，25為轉基因玉米BT176，26為轉基因玉米MON810，27為轉基因大豆A5547-127，28為H2O。自從PCR于1985年發明以來，有關核酸（DNA）的檢測多采用PCR法。目前檢測轉基因成分的主要方法是熒光PCR法。然而，需要昂貴的熒光PCR儀也是熒光PCR法檢測轉基因成分的缺點[12]。近幾年，盡管有很多非PCR方法檢測目的基因的方法被報道。但是，能夠達到與PCR法相同檢測限的方法很少[3]。該方法檢測限為0.5%，能夠滿足日常檢測的限量要求（歐盟和英國0.9%，巴西4%，澳大利亞和新西蘭1%，俄羅斯、中國香港、日本、中國臺灣5%，韓國和馬來西亞3%）。

已經有報道采用LAMP法檢測不同品系的轉基因植物如轉基因大米BT63，KMD和KF6[13]，轉基因大豆GTS 40-3-2[14]，轉基因玉米Bt176[15]。但是，對于含有多種原料的食品（餅干、面包、），很難逐一品系進行檢測。這時篩選檢測則是較好的選擇。轉基因篩選檢測常用的目的基因包括：CaMV35S、NOS、NPTII和FMV35S等。FMV35S基因是植物遺傳操作常用標記基因，可以作為一個重要的指標判定食品和飼料中是否含有轉基因成分。

試驗建立了一種檢測食品和飼料中FMV35S轉基因成分的LAMP方法。與經典PCR法相比，LAMP法更加快速、易操作，檢測結果肉眼可見，不需要復雜的檢測儀器。該方法的檢測限為0.5%，特異性和穩定性滿足日常檢測要求，對食品和飼料中日常的快速篩檢轉基因成分有重要的意義。

食品和飼料中轉基因植物FMV35S啟動子環介導等溫擴增檢測方法的建立參考文獻

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責任編輯 李占東 責任校對 況玲玲