不同消毒方式對華中枸骨組織培養的影響

范淑芳

摘要 [目的]考察不同消毒方式對華中枸骨組織培養的影響。[方法]以華中枸骨的帶芽新梢莖段為外植體，分頂芽和側芽，研究乙醇、升汞的作用時間以及吐溫的用量對外植體消毒的影響。[結果]華中枸骨新梢頂芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用6 min，Tween.80 1滴；側芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用7 min。[結論]該方法優化了華中枸骨組織培養的消毒方法，為華中枸骨的進一步開發利用提供依據。

關鍵詞 華中枸骨（Ilex centrochinensis）；組織培養；消毒方式

中圖分類號 S181.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05007-02

華中枸骨（Ilex centrochinensis）為冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬（Ilex）植物，又稱針齒冬青或小果冬青。該植物壽命長，枝葉繁茂，莖枝形態多變且葉形奇特，葉上荊刺長短對稱，碧綠常青且黃花紅果，是一種應用于建造庭院、樓臺美化、盆景造型、公園觀賞及寺廟仿古等的最佳天然植物材料之一；此外，該植物富含多種營養元素，可藥、茶兩用，且品質優良，是集觀賞與保健功能為一體的優質植物資源，故又被形象地稱為苦荊茶[1]。該植物種子繁殖與扦插繁殖均比較困難，其組培快繁的研究鮮有報道，嚴重限制了其推廣應用。筆者主要針對帶芽新梢莖段的消毒方法展開系統地試驗，以期找到最佳的消毒方法，減少無菌系建立中的損失，為其組培快繁服務[2-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。華中枸骨（Ilex centrochinensis），來源于湖北省黃岡市，于4月初采取長約5～10 cm、未木質化的新梢莖段作為外植體。

1.1.2 主要試劑。所用試劑均為國產分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒方法。將華中枸骨新梢修剪好后分頂芽和側芽各沖洗3遍、加洗衣粉水洗振蕩5 min、自來水沖洗1.5 h，再分別按表1正交設計表Lg（34）進行4因子3水平消毒處理，處理順序為：無菌水1遍，濃度75%乙醇，無菌水1遍，濃度0.1%升汞與吐溫同時加入，無菌水清洗5～6遍，每次3 min[5]。消毒后處理后每瓶豎接一個帶芽莖段，長約1 cm，頂芽每處理10瓶，重復3次，側芽每處理30瓶，重復3次。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒時間的確定

2.1.1 頂芽消毒時間的確定。由表2可知，華中枸骨新梢頂芽的消毒處理中，消毒效果之間的差異達到極顯著（P<0.01），濃度75%乙醇40 s，濃度0.1%升汞5 min，Tween.80 1滴的消毒效果較好。而就后期生長而言，濃度75%乙醇50 s、濃度0.1%升汞6 min、Tween.80 1滴的消毒處理對芽的形成與生長作用較好；濃度75%乙醇30 s、濃度0.1%升汞5 min的消毒處理則對愈傷的形成與生長較好。

2.1.2 側芽消毒時間的確定。由表3可知，華中枸骨新梢側芽的消毒處理中，消毒效果之間的差異達到極顯著（P<0.01），75%乙醇50 s、0.1%升汞7 min的消毒效果較好；而就后期生長而言，75%乙醇50 s、0.1%升汞7 min的消毒處理對芽的形成與生長作用較好，75%乙醇40 s、0.1%升汞6 min的消毒處理則對愈傷的形成與生長較好。

2.1.3 外植體中頂芽與側芽的差異。由表2、3相比較可知，外植體中頂芽與側芽所確定的較好的消毒處理方法不一致，見圖1，側芽不同消毒處理效果的變化趨勢要較頂芽平緩，說明不同的消毒處理對頂芽的消毒作用較側芽強；頂芽培養1個月后芽的萌動率明顯高于側芽，其不同消毒處理之間的芽萌動率的差異見圖2，其最大可相差83.84%（消毒處理5），說明頂芽比側芽更易于誘導芽的發生；頂芽愈傷的萌動率則明顯低于側芽；無變化的側芽也比無變化的頂芽的比率大。綜合考慮，如果以帶芽莖段誘導不定芽的方式來進行華中枸骨的組織培養和快速繁殖，頂芽明顯比側芽好，應優先選擇新梢頂芽作為外植體。

3 結論與討論

試驗結果表明，華中枸骨以帶芽的新梢莖段作為外植體進行消毒處理時，華中枸骨新梢頂芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用6 min，Tween-80 1滴；側芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用7 min。春季萌條中頂芽的芽萌動率明顯比側芽高，無變化的莖段所占的比例也比側芽低，消毒處理中的死亡率則比側芽高，可能原因為頂芽的生長勢較側芽強，且頂芽較側芽幼嫩。

參考文獻

[1] 李樹文.苦荊茶[J].特產研究，1991（1）：31，45.

[2] 肖顯華，王順珍，林榮雙，等.植物材料表面消毒方法的改進[J].生物技術，1999，9（1）：43-45.

[3] 王利民，周毅，陳龍友，等.植物組織培養中消毒劑的運用[J].貴州師范大學學報：自然科學版，2002，20（1）：15-17.

[4] 朱廣廉.植物組織培養中的外植體滅菌[J].植物生理學通訊，1996，32（6）：444-449.

[5] 孟玉玲，谷祝平.正交設計在誘導植物體細胞胚胎發生中的應用[J].西北植物學報，1995，15（1）：10-15.