大豆種質(zhì)對(duì)菌核病的耐病性評(píng)價(jià)及資源篩選

趙雪 呂春梅 韓英鵬 滕衛(wèi)麗 李文濱

摘要 [目的]探明大豆種質(zhì)資源對(duì)大豆菌核病的耐受性（部分抗性）水平，挖掘耐病種質(zhì)資源是選育抗病品種的前提和基礎(chǔ)。[方法]通過(guò)莖中可溶性色素法和離體葉柄接種法對(duì)130份大豆品種（系）進(jìn)行抗/耐病性評(píng)價(jià)。[結(jié)果]2種方法的評(píng)價(jià)結(jié)果相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.69，通過(guò)色素法鑒定得到耐病材料6份，中度耐病材料16份，通過(guò)葉柄接種法獲得高抗材料13份，囊括了色素法篩選得到的全部耐病材料和部分中耐材料。[結(jié)論]說(shuō)明色素法作為一種間接鑒定方法，篩選標(biāo)準(zhǔn)較葉柄接種法更為嚴(yán)格和精準(zhǔn)，適合大量種質(zhì)資源的耐病性篩選。

關(guān)鍵詞 大豆；菌核病；莖中可溶性色素水平；耐病性

中圖分類(lèi)號(hào) S565.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-05014-04

大豆菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）于1946年在加拿大安大略州首次被發(fā)現(xiàn)[1-2]，相繼在世界范圍內(nèi)擴(kuò)展傳播[3-5]。目前，大豆菌核病已成為僅次于大豆胞囊線蟲(chóng)的第二大世界性病害[6]。該病原菌為核盤(pán)菌屬，在大豆苗期、成株期均可發(fā)病，嚴(yán)重時(shí)可致植株死亡，嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量[7]。在生產(chǎn)上，抗病品種的利用可以有效地降低該病害帶來(lái)的產(chǎn)量損失。篩選對(duì)大豆菌核病具有抗性的種質(zhì)資源是選育抗病品種的前提和基礎(chǔ)。針對(duì)大豆種質(zhì)資源的抗菌核病鑒定研究，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。早在1987年，Boland等[8]報(bào)道大豆種質(zhì)資源中存在對(duì)菌核病的部分抗性即耐病性，大豆栽培種Maple Arrow為典型的部分抗性種質(zhì)。我國(guó)大豆菌核病抗病資源篩選研究開(kāi)始較晚，矯洪雙等[9]于1994年報(bào)道了大豆菌核病田間抗性鑒定，孫鮮鳳等[10]、王金生等[11]相繼報(bào)道了大豆菌核病抗性鑒定的研究，但多數(shù)研究所用的鑒定方式不盡相同。大豆菌核病抗性或部分抗性鑒定方法較多[12-16]，其中離體莖的可溶性色素法是一種快捷的鑒定手段，適合大量種質(zhì)資源的篩選。筆者采用該方法對(duì)130份栽培大豆種質(zhì)資源進(jìn)行耐感性初評(píng)，并利用離體葉柄法結(jié)果與之比較，進(jìn)一步確認(rèn)鑒定結(jié)果的可行性和精準(zhǔn)性，為大豆抗菌核病種質(zhì)資源大量篩選工作提供支持，同時(shí)為抗病親本的選擇和優(yōu)異抗病基因的挖掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株。采集東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地大豆種植田中發(fā)病株的菌核，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)分離出菌絲，保存于培養(yǎng)基中備用。

1.1.2 供試大豆種質(zhì)資源。供試材料包括生產(chǎn)推廣的大豆品種及優(yōu)良品系共130份（表1），感病對(duì)照品種為合豐25[17]，抗病對(duì)照品種為Maple Arrow[8]。

1.2 鑒定方法

1.2.1 莖中可溶性色素法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。莖中可溶性色素法（簡(jiǎn)稱(chēng)色素法）參考孫鮮鳳等[10]的方法，并在實(shí)施中加以改進(jìn)。具體方法：將供試材料播種于溫室盆栽，12 h光暗交替，每份材料保苗 10 株。在第一復(fù)葉展開(kāi)時(shí)期選取長(zhǎng)勢(shì)一致的大豆植株，自子葉痕處剪斷，并剪去所有葉片，用濃度40 mmol/L草酸處理48 h后，測(cè)定試管中草酸溶液在 518 nm處的吸光值（OD518）。每份材料重復(fù)5次，取OD518平均值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.2 離體葉柄接種法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)核盤(pán)菌，活化6 d后的菌絲體用于接種鑒定。接種和抗性分級(jí)參照矯洪雙等[15]的方法，略改進(jìn)。在長(zhǎng)寬高為70 cm×40 cm×15 cm的矩形塑料盒內(nèi)鋪5 cm厚的蛭石，用滅菌蒸餾水完全浸潤(rùn)后，將紗布鋪于上層，采集田間盛花期大豆植株生長(zhǎng)點(diǎn)以下第4個(gè)節(jié)上生長(zhǎng)的葉柄置于紗布上，接種直徑1 cm帶有核盤(pán)菌活化菌絲的瓊脂塊，敷保鮮膜保濕，放置在（25±2）℃、12 h光照環(huán)境下觀察其菌絲侵染情況。接種后以第7天莖腐長(zhǎng)度作為評(píng)價(jià)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。將葉柄腐爛嚴(yán)重度記載標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為0～4級(jí)，分別為免疫、高抗、中抗、中感和感病類(lèi)型。0級(jí)：接種處無(wú)明顯病斑；1級(jí)：接種處病斑長(zhǎng)度1～3 cm；2級(jí)：接種處病斑長(zhǎng)度在3～6 cm；3級(jí)：接種處病斑長(zhǎng)度在6～8 cm；4級(jí)：接種處病斑長(zhǎng)度在8 cm以上，病斑繞葉柄，并有黑色菌核產(chǎn)生[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖中可溶性色素法鑒定結(jié)果 參試的130份大豆種質(zhì)資源莖中可溶性色素水平分布情況見(jiàn)圖1。頻數(shù)分布顯示，草酸處理后的供試材料在518 nm下的吸光值為0.001～0.058，其中耐病標(biāo)準(zhǔn)品種Maple Arrow的吸光值為0.058，為供試品種中的最大值，感病對(duì)照品種合豐25的吸光值為0.009，吸光值低于感病對(duì)照品種的材料占總體的54%，說(shuō)明對(duì)菌核病敏感的品種在種質(zhì)資源中占主體地位（圖1A）。

圖1B虛線指示吸光值的經(jīng)驗(yàn)分布右尾分界線，0.05水平經(jīng)驗(yàn)分布臨界值為0.048，說(shuō)明吸光值高于該臨界值的材料耐病水平顯著高于其他材料。以此臨界值為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合前人研究的耐病性劃分方法，進(jìn)一步確定了較為合理的劃分標(biāo)準(zhǔn)（表2）。將供試材料按此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分，篩選出感病材料71份（54.62%），中度感病材料37份（28.46%），中度耐病材料16份（12.31%）以及耐病材料6份（4.62%）（圖2）。

2.2 葉柄接種法鑒定結(jié)果 為了進(jìn)一步證明莖中可溶性色素法對(duì)耐感性鑒定的準(zhǔn)確性，利用離體葉柄接種法對(duì)參試材料進(jìn)行了評(píng)價(jià)。葉柄腐爛長(zhǎng)度為1.0～13.5 cm，與莖中可溶性色素水平整體呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）絕對(duì)值為0.69，根據(jù)相關(guān)顯著水平判斷標(biāo)準(zhǔn)（P<0.01，130樣本的R2臨界值為0.23），兩者達(dá)到極顯著相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明2種鑒定方法結(jié)果一致性較好（圖2）。

按照矯洪雙等[15]的5個(gè)級(jí)別的抗性劃分方法，將供試材料進(jìn)行分類(lèi)。整體而言，未篩選到完全免疫的類(lèi)型，供試材料分布在除0級(jí)以外的4個(gè)級(jí)別中，其中高度感病類(lèi)型（4級(jí)）材料居多，占總體的79.23%。篩選到抗病材料（1級(jí)）13個(gè)，占總體的10%，其余為中間過(guò)渡類(lèi)型（圖3）。

圖3 色素測(cè)定法與葉柄接種法鑒定結(jié)果比較 通過(guò)葉柄接種法和色素測(cè)定法對(duì)抗/耐/感病類(lèi)型劃分結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，葉柄接種法鑒定為感病（3和4級(jí)）的材料中包含了色素測(cè)定法鑒定結(jié)果中的全部感病類(lèi)型和絕大部分中度感病類(lèi)型，而高抗類(lèi)型（1級(jí)）則囊括了色素法鑒定出的全部耐病類(lèi)型和吸光值相對(duì)較高的8個(gè)中度耐病類(lèi)型（表3），由此說(shuō)明2種方法對(duì)抗源的篩選和高度感病材料的鑒定具有較好的一致性和較高的效力。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)作為栽培大豆的起源地，種質(zhì)資源非常豐富，其中不乏優(yōu)異基因資源等待被挖掘和利用。抗病資源的篩選作為抗病品種選育和新基因發(fā)掘的基礎(chǔ)研究具有重要意義。針對(duì)菌核病的抗感性鑒定，國(guó)內(nèi)外研究人員開(kāi)發(fā)出包括室內(nèi)和室外鑒定的多種方式以適應(yīng)不同試驗(yàn)的需要，然而多種方法建立的評(píng)價(jià)體系不盡相同使得同類(lèi)研究難以進(jìn)行平行比較[12-15]。

該研究利用2種室內(nèi)鑒定方法對(duì)130份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行菌核病耐病性進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較，其中莖中可溶性色素法是一種間接的鑒定手段[18-19]，它是建立在核盤(pán)菌的草酸發(fā)病機(jī)制基礎(chǔ)上[20]，通過(guò)植株對(duì)一定濃度草酸的耐受性模擬菌絲接種，具有較好的重復(fù)性[17]，試驗(yàn)條件易于控制，該研究對(duì)耐病標(biāo)準(zhǔn)品種和感病對(duì)照品種的草酸耐受性評(píng)價(jià)結(jié)果與其他同類(lèi)研究得到的結(jié)果基本一致，可以實(shí)現(xiàn)不同研究結(jié)果的平行比較和整合。

離體葉柄接種法作為一種直接接種方法，通過(guò)調(diào)查葉柄腐爛程度能夠較直觀地反映待測(cè)材料的抗感性水平，在該研究中作為色素法評(píng)價(jià)結(jié)果的驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)2種鑒定結(jié)果整體相關(guān)系數(shù)達(dá)0.69，同時(shí)對(duì)極端耐/感品種劃分的一致性說(shuō)明2種方法對(duì)耐病資源的篩選均具可靠性和準(zhǔn)確性。比較中間過(guò)渡類(lèi)型材料的劃分結(jié)果，顯示出一定程度的不一致，說(shuō)明2種方法在分辨中度耐/感類(lèi)型材料方面存在局限性，需要在后續(xù)研究中對(duì)劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合理優(yōu)化。另外，該研究發(fā)現(xiàn)品系DY2004-1在2種評(píng)價(jià)方法中出現(xiàn)相反的結(jié)果，即莖腐長(zhǎng)度符合感病類(lèi)型級(jí)別而莖中可溶性色素水平達(dá)到中度耐病級(jí)別，推測(cè)在菌核病抗病或耐病性方面可能存在其他機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

該研究通過(guò)2種篩選方法獲得的6份耐病大豆種質(zhì)中，Maple Arrow 為世界公認(rèn)的加拿大耐病品種[14]，其余5份來(lái)自黑龍江和遼寧的耐病種質(zhì)未見(jiàn)與前人研究結(jié)果的交叉，為該研究首次鑒定為耐病的種質(zhì)，可作為大豆菌核病抗病育種的新資源加以利用。

參考文獻(xiàn)

[1] KOCH L M，HIDEBRAND A A.Soybean diseases in southwestern Ontario in 1946[J].Canadian Plant Disease Survey，1946，26：27-28.

[2] HILDEBRAND A A.Soybean diseases in Ontario[J].Soybean Digest，1948，10：16-17.

[3] GRAU C R，RADKE V L，GILLESPIE F L.Resistance of soybean cultivars to Sclerotinia sclerotiorum[J].Plant Disease，1982，66：506-508.

[4] CLINE M N，JACOBSEN B J.Methods for evaluating soybean cultivars for resistance to Sclerotinia sclerotiorum[J].Plant Disease，1983，67：784-786.

[5] BOLAND G J，HALL R.Growth room evaluation of soybean cultivars for resistance to Sclerotinta sclerotiorum[J].Canadian Journal of Plant Science，1986，66：559-564.

[6] WRATHER J A，ANDERSON T R，ARSYAD D M，et al.Soybean disease loss estimates for the top 10 soybean producing countries in 1994[J].Plant Disease，1997，81：107-110.

[7] 張波，王國(guó)慶，王桂華，等.大豆菌核病發(fā)病因素分析與防治方法[J].雜糧作物，2004，24（1）：48-49.

[8] BOLAND G L，HALL R.Evaluating soybean cultivars for resistance to Sclerotina sclerotiorum under field conditions[J].Plant Disease，1987，71：934-936.

[9] 矯洪雙，程志明，許修宏，等.大豆種質(zhì)資源對(duì)菌核病的抗性鑒定研究[J].大豆科學(xué)，1994，13（4）：351-355.

[10] 孫鮮鳳，滕衛(wèi)麗，李冬梅，等.大豆新品種（系）的菌核病耐病性鑒定[J].大豆科學(xué)，2011，30（5）：834-837.

[11] 王金生，于安亮，徐鵬飛，等.栽培大豆種質(zhì)資源對(duì)大豆茵核病的抗性評(píng)價(jià)[J].大豆科學(xué)，2009，28（6）：1054-1057.

[12] AULAIR J，BOLAND G J，KOHN L M，et a1.Genetic interactions between Glycine max and Sclerotinia scerotiorum using a straw inoculation method[J].Plant Disease，2004，88（8）：891-895.

[13] CHEN Y，WANG D.Two convenient methods to evaluate soybean for resistance to Sclerotinia sclerotiorum [J].Plant Disease，2005，89（12）：1268-1272.

[14] GRAU C R，RADKE V L.Effects of cuhivars and cultural practices on Sclerotinia stein rot of soybean[J].Plant Disease，1984，68（1）：56-58.

[15] 矯洪雙，程志明，許修宏，等.大豆對(duì)菌核病室內(nèi)抗性鑒定方法研究[J].大豆科學(xué)，1996，15（4）：295-301.

[16] PENNYPACKER B W，HATLEY O E.Greenhouse technique for detection of physiological resistance to Sclerotinia sclerotiorum in soybean[J].Phytopathology，1995，85：1178.

[17] 孫明明，韓英鵬，陳浩，等.大豆菌核病鑒定方法比較及分析[J].大豆科學(xué)，2007，26（5）：728-731.

[18] KOLKMAN J M，KELLY J D.An indirect test using oxalate to determine physiological resistance to white mold in common bean[J].Crop Science，2000，40：281-285.

[19] LI D M，SUN M M，HAN Y P，et al.Identification of QTL underlying soluble pigment content in soybean stems related to resistance to soybean white mold （Sclerotinia sclerotiorum）[J].Euphytica，2010，172：49-57.

[20] FERRAR P H，WALKER J R.o-Diphenol oxidase inhibition-an additional role for oxalic acid in the phytopathogenic arsenal of Sclerotinia sclerotiorum and Sclerotium rolfsii[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1993，43（6）：415-422.