復凝聚法制備蘇云金桿菌微膠囊

李姍 王志英

摘要 [目的]探討復凝聚法制備以明膠和阿拉伯膠為壁材的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）微膠囊的工藝。[方法] 通過單因素試驗，研究了明膠濃度、阿拉伯膠濃度、芯壁比、pH、反應溫度和轉速對微膠囊包埋效率的影響，再通過正交優化試驗確定最佳制備條件。利用光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡和粒徑測微儀對蘇云金桿菌微膠囊形態及粒徑分布進行表征。[結果] 復凝聚法制備蘇云金桿菌微膠囊最佳工藝條件為明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶1，復凝聚反應pH 3.6，溫度40 ℃，攪拌速度550 r/min。在此條件下的包埋率達82.32%，粒徑分布均勻且平均粒徑在28.29 μm左右流動性好的球型固體微膠囊。 [結論] 該微膠囊符合實際應用需求，為殺蟲劑的研制提供了理論依據。

關鍵詞 蘇云金桿菌；明膠；阿拉伯膠；復凝聚法；微膠囊

中圖分類號 S482.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05020-04

蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt） 制劑是目前世界上研究最深入、產量最大、應用最廣泛、對非目標生物無任何不利影響的微生物殺蟲劑之一[1-2]，被廣泛應用于農業、林業、衛生害蟲的生物防治中。但由于蘇云金桿菌制劑野外應用存在殘效期短、防效不穩定、易受陽光、溫度、濕度等外界條件制約等缺點[3]，筆者以明膠和阿拉伯膠為壁材，利用成囊技術包埋蘇云金芽孢桿菌，制成微膠囊以提高菌體的穩定性、增強其耐紫外照射、耐高溫的能力，便于對其保存和使用。

微膠囊技術包含物理法、化學法、物理化學法等[4]。復凝聚法是物理化學法中相分離法的一種，它利用2種帶相反電荷的天然或合成的高分子材料在一定條件下相反電荷的高分子材料互相交聯，形成復合物后溶解度降低自溶液中凝聚析出而成囊。復凝聚法是制備微膠囊的重要方法之一，在國內外已有廣泛的應用和研究，主要用于醫藥、農藥、食品、肥料等領域。國內，范光龍等[5]以明膠與阿拉伯膠作為壁材，制備薄荷油微膠囊，含油量為90.2%。孫鋒等[6]以香蕉油香精為芯材，阿拉伯膠、氧化淀粉和明膠為壁材，包埋率達50%，所得薄荷油微膠囊和香蕉油香精微膠囊都降低其常溫下的揮發，提高了薄荷油和香蕉油香精的穩定性。李武明等[7]探討了以殼聚糖及海藻酸鈉為壁材制備耐酸的雙歧桿菌微囊效果最佳。李鶴等[8]以明膠和阿拉伯膠為壁材制備昆蟲蛻皮激素微膠囊，包覆率為63.4%。馬麗杰等[9]和周小敏等[10]分別以殼聚糖和木質素磺酸鈉，明膠和阿拉伯膠為囊材將阿維菌素包埋成微膠囊，包埋率均超過82%。陸繼鋒等[11]以有機磷殺蟲劑辛硫磷為囊芯采用復凝聚法制備辛硫磷微膠囊，增強了囊芯的穩定性，延長了殺蟲劑的藥效。在國外，復凝聚法制備的微膠囊劑也廣泛應用于各個行業。CHANG等[12]以明膠和阿拉伯膠為壁材，樟腦油為芯材，制備微膠囊，包埋率達到 99.6%；通過油溶性的聚苯乙烯，改善樟腦油微膠囊的緩釋效果。目前，復凝聚法中最常見的壁材有明膠、阿拉伯膠、殼聚糖、木質素磺酸鈉、海藻酸鈉等，筆者以明膠（GE）和阿拉伯膠（AG）為壁材[13]，探討了壁材濃度、壁材比例、芯壁材比、pH、反應溫度和轉速等因素對復凝聚過程的影響，確定了蘇云金桿菌微膠囊的制備體系，表征蘇云金桿菌微膠囊的微觀結構，為開發新型微生物農藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種：蘇云金桿菌庫斯塔克亞種（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki，Btk，質量50 000 IU/mg；湖北康欣農用公司）。

試劑：明膠（SIGMA.ALDRICH），阿拉伯膠（AMRESCO），吐溫80（AMRESCO），戊二醛（國藥集團化學試劑有限公司），冰乙酸（國藥集團化學試劑有限公司），氫氧化鈉（天津廣成化學試劑有限公司），其余試劑購自于天津廣成化學試劑有限公司，去離了水（實驗室自制）。

儀器：電子天平（AR2130，梅特勒-托利多儀器有限公司），磁力攪拌器（德國SLK），電動攪拌器（德國 CY1L6.PS.NCY1L6H.A.N），高速離心機（D.37520，德國Osterode公司），電子掃描顯微鏡（JSM.6460LV，日本JEOL），激光粒度分析儀（ BT.9300H，丹東市百特儀器有限公口），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司，DHG.9030A北京），pH計，生物顯微鏡（奧林巴斯有限公司上海分公司）。

1.2 蘇云金芽孢桿菌微膠囊的制備 把蘇云金芽孢桿菌菌粉配成一定濃度的菌液，加入一定量20%Tween 80，置于磁力攪拌器進行攪拌，攪拌速度控制在低速300 r/min，制成蘇云金芽孢桿菌懸浮液。鏡撿菌液分散均勻后加入適量的明膠水溶液，溫度緩慢升至40 ℃恒溫，待體系攪拌一段時間后，將等量的阿拉伯膠水溶液加入到上述乳液中并調整轉速到400 r/min，攪拌均勻后，緩慢滴加10%醋酸溶液調節系統pH至4，一段時間后，繼續攪拌，將體系置于冰浴中，使溫度降到5～10 ℃，加入10%的NaOH溶液調節pH至8～9，加入一定量的固化劑戊二醛（25%）溶液1 ml低溫下攪拌1 h后，取出微膠囊溶液進行離心處理，用去離子水將離心管下方的微膠囊沉淀洗滌，最后得到的微膠囊室溫晾干，干燥后的物質為蘇云金芽孢桿菌微膠囊粉末，4 ℃下保存。

1.3 蘇云金芽孢桿菌微膠囊的形態特征觀察 將所制微膠囊懸浮液滴一滴到載玻片上，用光學顯微鏡觀察微膠囊的形態。在掃描電子顯微鏡樣品臺上貼一層雙面膠將微膠囊粉末輕輕撒在上面，輕輕吹去多余的粉末，離子濺射儀鍍金1 min后，在掃描電子顯微鏡下對微膠囊的表面形態和粒徑進行觀察。

1.4 蘇云金芽孢桿菌微膠囊包埋率的測定 取0.1 g菌粉配成菌懸液，測其菌數（B0），另取同樣重量的菌粉所制微膠囊等體積溶液，測其菌數（B1），則包埋率=1-B1/B0[14]。

1.5 粒徑檢測 采用BT.2003型激光粒度分布儀進行測定，每個樣品測定3次。

1.6 單因素優化微膠囊制備工藝

1.6.1 明膠濃度對微膠囊形成的影響。選取明膠濃度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，阿拉伯膠濃度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH3.5，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后沉淀洗滌，測定包埋率。

1.6.2 阿拉伯膠濃度對微膠囊形成的影響。選取阿拉伯膠濃度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，明膠濃度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH3.5，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后沉淀洗滌，測定包埋率。

1.6.3 芯壁比對微膠囊形成的影響。芯壁比選取3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，明膠濃度1.5%，阿拉伯膠濃度1.5%，成囊pH3.5，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后沉淀洗滌，測定包埋率。

1.6.4 成囊pH對微膠囊形成的影響。pH選取3.0、3.4、3.8、4.2和4.6，明膠濃度1.5%，阿拉伯膠濃度1.5%，芯壁比1∶1，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后沉淀洗滌，測定包埋率。

1.6.5 成囊溫度對微膠囊形成的影響。反應溫度選取30、40、50、60和70 ℃，明膠濃度1.5%，阿拉伯膠濃度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH 3.5，攪拌速度500 r/min，反應結束后沉淀洗滌，測定包埋率。

1.6.6 轉速對微膠囊形成的影響。轉速選取300、400、500、600和700 r/min，明膠濃度1.5%，阿拉伯膠濃度1.5%，芯壁比1∶1，成囊pH 3.5，反應溫度40 ℃，反應結束后沉淀洗滌，測定包埋率。

1.7 正交優化微膠囊制備工藝 針對單因素影響因子的試驗結果，選出對微膠囊包埋率影響較大的4個因素進行正交試驗。選用L9（34）正交表進行試驗，通過正交試驗確定最佳的包囊條件，其試驗因素水平見表1。

1.8 數據處理 數據均用平均值表示，采用Excel 2003和正交設計助手Ⅱ進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 明膠濃度對微膠囊形成的影響。由圖1可知，微膠囊的包埋率隨明膠濃度的增大呈先升高后下降的趨勢，在濃度為1.0%時包埋率達72.44%。0.5%～4.0%明膠制成的微膠囊的包埋率分別為50.38%、72.44%、58.85%、42.30%和25.72%。由此可知，低濃度明膠溶液條件下制備出的微膠囊具有較高的包埋效率，低濃度有利于物質的溶解，易分散在體系里，與阿拉伯膠反應時能防止壁材過量而造成體系黏稠，但濃度太低也不利于微膠囊的形成，低濃度不能提供足夠的電荷與阿拉伯膠反應。明膠濃度為0.5%、1.0%和2.0%的微膠囊包埋率高于明膠濃度為3.0%和4.0%的微膠囊。綜上所述，低濃度明膠的微膠囊可以提高包埋率，高濃度的明膠不利于復凝聚反應的進行。同時造成囊壁致密，厚度增大，不利于囊芯的釋放，濃度繼續加大時，微膠囊之間還易出現粘連現象。因此，明膠的濃度應控制在0.5%～3.0%。

2.1.2 阿拉伯膠濃度對微膠囊形成的影響。由圖2可知，隨阿拉伯膠濃度的增大蘇云金桿菌微膠囊的包埋率變化較大，在濃度為2.0%時包埋率最大71.10%。0.5%～4.0%膠濃度制成的微膠囊的包埋率分別為35.40%、66.45%、71.10%、34.11%和10.04%。由此可知，阿拉伯膠濃度為1.0%和2.0%所制微膠囊的包埋率高于阿拉伯膠濃度為0.5%、3.0%和4.0%的微膠囊，阿拉伯膠濃度為3.0%和4.0%時，溶液黏度增大易粘連。綜上所述，阿拉伯膠濃度為1.0%～2.0%時有利于微膠囊形成。

2.1.3 芯壁比對微膠囊形成的影響。

3可知，隨芯壁比的增大，包埋率呈先升后降的趨勢，芯壁比為1∶1時微膠囊的包埋率最大為62.64%。芯壁比為1∶ 3、1∶ 2、1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1時制成的微膠囊的包埋率分別為37.36%、51.03%、62.64%、25.97%和12.32%。由此可知，芯壁比為1∶1和1∶2的微膠囊的包埋率高于芯壁比為3∶1、2∶1和1∶3的微膠囊。綜上所述，芯壁比過大，芯材過量會導致包埋率下降，壁材過少不能完全將芯材包覆，使得大量的囊芯粘在微膠囊表面，囊壁膜變薄。芯壁比過小，囊壁濃度過大也易粘連，形成的囊壁變厚，不利于囊芯的釋放。

2.1.4 pH對微膠囊形成的影響。由圖4可知，在pH為3.0～4.5時制成微膠囊的包埋率分別為67.18%、72.05%、79.16%、68.36%和50.38%。由此得知，隨pH的增大包埋率先增大后減小，pH為3.4和3.8的微膠囊包埋率高于pH為3.0和4.2的微膠囊，在pH為3.8時微膠囊包埋率最高。這是由明膠和阿拉伯膠的性質所決定的，在水溶液中明膠分子中的正負電荷數量受介質pH的直接影響。當pH為3.0～4.2時明膠中正電荷達最大，在此條件下加入帶負電荷的阿拉伯膠溶液，此時彼此的靜電作用處于最理想狀態，明膠和阿拉伯膠產生凝聚現象而形成微膠囊[4]。當pH小于3.0時，也不能得到聚合物，這是因為在較強酸性條件下，縮聚生成的微膠囊易分解為小分子。

2.1.5 溫度對微膠囊形成的影響。由圖5可知，反應溫度從30～70 ℃，制成微膠囊的包埋率分別為53.66%、78.05%、64.33%、34.83%和20.76%。由此可知，40和50 ℃微膠囊的包埋率高于反應溫度30和60 ℃的微膠囊，反應溫度為40 ℃時包埋率最高為78.05%。綜上所述，反應溫度為40 ℃左右時有利于微膠囊形成。

2.1.6 轉速對微膠囊形成的影響。由圖6可知，微膠囊的包埋率隨轉速的增加呈先升高后降低趨勢，500 r/min時包埋率最大為81.04%。制成的微膠囊的包埋率分別為42.99%、66.01%、81.04%、68.74%和53.99%。由此得知，攪拌速度為500和600 r/min條件下制備的微膠囊的包埋率高于攪拌速度為700 r/min條件下制備的微膠囊。表明低轉速下有利于復凝聚反應的進行，高轉速下易使反應體系紊亂，阻礙復凝聚反應的發生。因此，將攪拌速度控制在低轉速下即可保證反應的正常進行。

2.2 正交試驗結果 根據單因素試驗結果，選取明膠濃度、阿拉伯膠濃度、pH、轉速4個因素，以微膠囊包埋率為指標，設計L9（34）正交試驗，試驗結果見表2。

由表2可知，影響包埋率的各因素主次順序為A >C >B >D，即明膠濃度的影響最大，其次是pH，阿拉伯膠濃度和轉速對包埋效果的影響都較小，最佳組合為A1C2B1D3，即最佳包埋工藝條件為：明膠濃度1.0%、阿拉伯膠濃度1.0%、pH 3.6、轉速550 r/min。并以此條件制備蘇云金芽孢桿菌微膠囊。

2.3 蘇云金芽孢桿菌微膠囊的形態特征 利用光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡對最優條件下制備的蘇云金芽孢桿菌微膠囊的微觀結構和整體分布進行表征，結果見圖7。由圖7可知，在水分散體系中，蘇云金芽孢桿菌微膠囊呈球形，單分散性好，形態規則，大小較均勻。由圖8可知，蘇云金芽孢桿菌微膠囊成囊性及密封性良好，囊皮材料包裹緊實，雜質殘留較少。

2.4 蘇云金芽孢桿菌微膠囊化的包埋率 采用血球計數板計數法，根據“1.4”中方法和公式計算出上述最優工藝條件下所制備的蘇云金芽孢桿菌微膠囊的包埋率為82.32%。

2.5 粒徑分布 利用激光粒度分析儀測定蘇云金芽孢桿菌微膠囊的粒徑大小，蘇云金芽孢桿菌微膠囊粒徑分布見圖9。由圖9可知，蘇云金芽孢桿菌微膠囊粒徑呈正態分布，大粒徑的微膠囊極少存在。測出不同粒徑的分布范圍，得出中位徑為28.29 μm。總含量90%微膠囊可通過300目的篩子。

3 結論與討論

該研究以明膠和阿拉伯膠為壁材，蘇云金芽孢桿菌為芯材，采用復凝聚法制備蘇云金芽孢桿菌微膠囊，表征了微膠囊的超微結構、包埋率及粒徑分布。結果表明，通過單因素試驗和正交試驗，得出影響微膠囊包埋率的主次順序為明膠濃度>pH>阿拉伯膠濃度>轉速。最佳工藝條件：明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶1，復凝聚反應pH 3.6，溫度40 ℃，攪拌速550 r/min。在此工藝條件下得到的微膠囊產品的包埋率可達82.32%，粒徑分布均勻且平均粒徑在28.29 μm。包埋率是評價微膠囊化產品質量的指標，包埋率高，表明芯材大多被包埋在微膠囊壁基質內，留在微膠囊產品表面的芯材含量少。將蘇云金芽孢桿菌微膠囊化，可減少孢子粉用量，提高芯材物質的穩定性，有效避免紫外照射[15-16]，緩慢釋放且延長殺蟲活性。減少了對人畜的刺激、環境的污染和對農作物的藥害，是一種環境友好型制劑[17]。故對所制微膠囊劑的防紫外線程度、殺蟲效果還有待進一步研究、完善。

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責任編輯 李占東 責任校對 況玲玲