溫差—超聲波復合法破壁山茶蜂花粉的研究

劉功良 馬磊 唐漢良 陳嘉玲 白衛東

摘要 [目的]優化溫差-超聲波復合法破壁山茶蜂花粉的工藝條件。[方法]以山茶蜂花粉為原料，采用溫差并結合超聲波輔助的復合破壁法對山茶蜂花粉進行破壁，使花粉破碎，釋放出內容物。利用單因素試驗和正交試驗方法研究溫差破壁和超聲波破壁的最佳試驗條件。[結果]試驗獲得溫差破壁最佳試驗條件如下：溫差100 ℃，料液比1∶7 g/ml，冷凍時間24 h，水浴時間5 h，水浴溫度45 ℃。在此條件下測得破壁率為68.75%，可溶性總糖的含量為40.02%，游離α.氨基氮的含量為3.58%。對溫差處理過的樣品進行超聲波輔助破壁的最優工藝為：在超聲10 min的情況下，測得破壁率為72.41%，可溶性總糖含量為46.08%，游離α.氨基氮含量為3.81%。[結論]該方法破壁效果比較好、成本低、可用于小規模生產。

關鍵詞 山茶蜂花粉；破壁；溫差；超聲波

中圖分類號 S896.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05233-03

蜂花粉是蜜蜂采集植物的花粉加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花粉形成的不規則扁圓形團狀物。它不僅含有豐富的蛋白質、碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質、酶類，還含有對人體生理功能具有特殊功效的核酸、黃酮等生物活性物質[1-2]。但花粉有堅韌的細胞壁，對胃酸和消化系統酶為非常穩定的理化特性[3]，這樣既影響了營養成分的吸收利用，也阻止了提取時營養物質的釋放，因此蜂花粉的破壁及破壁方法尤為重要[4-5]。茶花粉具有特殊的茶香氣息，味道微甜，呈橘紅色，微堿性，涼爽無毒。它富含蛋白質、氨基酸、脂肪酸、維生素、活性酶等多種有效活性成分[6-7]，山茶蜂花粉外壁不易被胃腸道消化，必須進行特殊的破壁處理才能使營養成分大量釋放出來，被人體消化吸收。

蜂花粉細胞“破壁”是指對蜂花粉單細胞的細胞壁及其萌發孔進行整體破壞或僅破壞萌發孔的閉鎖點。花粉細胞會受到不同程度的損傷，花粉內含營養物質釋放出來，以利于人體吸收和利用[8-9]。筆者以山茶蜂花粉為原料，利用單因素試驗和正交試驗方法研究溫差破壁和超聲波破壁的最佳試驗條件，使花粉破碎，釋放出內容物。

1 材料與方法

1.1 材料 供試山茶蜂花粉由廣州蜂嘜蜂業有限公司提供。主要試劑：葡萄糖（分析純），廣州一馬環保科技有限公司；甲醛溶液（分析純），天津市大茂化學試劑廠；98%濃硫酸（分析純），廣州化學試劑；蒽酮試劑（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 破壁率、可溶性總糖、游離α.氨基氮的檢測

1.2.1 破壁率的計算方法。采用破壁方法處理后，取混懸液制片，鏡檢。鏡檢計算時，使用生物顯微鏡10×20放大倍數，機械推進定位5個視野，記錄破壁蜂花粉粒總數目和完整蜂花粉粒數目[10]。計算公式：

破壁率%=已破壁花粉粒數/觀察花粉總粒數×100

1.2.2 蒽酮比色法測定可溶性總糖。葡萄糖標準曲線的制作：吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6 ml標準葡萄糖工作液，置入25 ml比色管中，并補水至2.0 ml，加6.0 ml蒽酮試劑，于沸水浴加熱5 min，冷卻，波長620 nm，1 cm比色皿，0號管為空白，測定吸光度，以葡萄糖量（μg）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

可溶性總糖的測定：將水浴完的山茶花粉液體在5 000 r/ min下離心5 min，取5支25 ml比色管，分別加入0.125 ml不同溫差的上清液，定容至25 ml，即稀釋200倍。再從稀釋了200倍的液體中分別吸取1 ml加入到另5支比色管中，定容至10 ml，即一共稀釋了2 000倍。取5支試管，標記為1、2、3、4、5，分別加入對應溫差的稀釋液2.0 ml，再分別加入6.0 ml蒽酮試劑，沸水浴5 min，冷卻，測吸光值。計算公式：

式中，m為由吸光值查得對應的葡萄糖的含量（μg），a為從總樣品液中取0.125 ml上清液相差的倍數，M為蜂花粉的質量（g）。

1.2.3 甲醛滴定法測定游離α.氨基氮。游離α.氨基氮的測定：吸取0.5 ml上清液，加25 ml去離子水，3滴酚酞試劑，搖勻后用0.01 mol/L的NaOH標準溶液滴至微紅。再加入10 ml中性甲醛溶液，靜置片刻，再用0.01 mol/L的NaOH標準溶液滴定回到微紅色終點，記下甲醛加入后樣品消耗NaOH標準溶液的體積。同樣，取25.5 ml水按以上操作做空白試驗。計算公式：

式中，V為加入甲醛后樣品消耗的NaOH標準液的體積（ml），C為NaOH的濃度（ mol/L），0.014為消耗1 ml 1 mol/L NaOH標準液相當于氮的質量（g），0.5為取離心后的上清液0.5 ml，b為蜂花粉與去離子水混合后的體積（0.1 ml），m為花粉的質量（g）。

1.3 方法

1.3.1 溫差對山茶蜂花粉破壁的影響。將5小袋5 g經過研磨的蜂花粉，置于-18 ℃的冰箱中24 h。在相同的料液比（1∶5 g/ml）、水浴溫度（45 ℃）、水浴時間（5 h）下，考察70、80、90、100、110 ℃[11]這5種不同溫差下山茶蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計算最佳溫差條件下的破壁率。

1.3.2 料液比對山茶蜂花粉破壁的影響。將5小袋5 g經過研磨的蜂花粉，置于-18 ℃的冰箱中24 h。在100 ℃的溫差下，分別以1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11 g/ml的料液比進行解凍，然后置于45 ℃的水浴鍋中水浴5 h[12]。測定不同料液比下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計算最佳料液比下的破壁率。

1.3.3 水浴時間對山茶蜂花粉破壁的影響。稱取5小袋5 g經研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中冷凍 24 h，用 82 ℃（溫差100 ℃）的熱水以1∶5 g/ml 的料液比進行解凍，再于45 ℃水浴溫度下分別水浴 4、5、6、7、8 h，檢測不同水浴時間下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計算最佳水浴時間條件下的破壁率。

1.3.4 冷凍時間對山茶蜂花粉破壁的影響。稱取5小袋5 g經研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中分別冷凍6、12、24、36、48 h，用 82 ℃（即溫差100 ℃）的熱水以 1∶5 g/ml的料液比進行解凍，再于45 ℃水浴溫度下水浴 5 h，檢測不同冷凍時間下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮，并計算最佳的冷凍時間下的破壁率。

1.3.5 水浴溫度對山茶蜂花粉破壁的影響。將5小袋5 g經過研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中冷凍 24 h，用 82 ℃（溫差100 ℃）的熱水以 1∶5 的料液比進行解凍，再于30、35、40、45、50 ℃這5個水浴溫度下水浴5 h，檢測不同水浴溫度下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計算最佳水浴溫度下的破壁率。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖的標準曲線 試驗得葡萄糖標準曲線見圖1。

2.2 溫差對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖2可得，選擇 100 ℃ 為適宜溫差。在此溫度下算得可溶性總糖含量為27.8%，游離α.氨基氮的含量為2.86%。在此條件計算破壁率，在顯微鏡下觀察到山茶蜂花粉粒總數為46，破壁蜂花粉粒數為31，由此算得破壁率為67.39%。

圖2 溫差對山茶蜂花粉破壁的影響2.3 料液比對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖3可知，選擇1∶5 g/ml為最佳的料液比。測得可溶性總糖含量為30.59%，游離α.氨基氮含量為2.35%。在顯微鏡下觀察得到花粉粒總數為51，破壁花粉粒數為35，算得破壁率為68.63%。

2.4 水浴時間對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖4可知，選擇5 h為最佳水浴時間，測得吸光值為0.215，算得可溶性總糖含量為27.1%，游離α.氨基氮含量為2.43%。通過此條件計算破壁率，在顯微鏡下觀察得到花粉粒總數為49，破壁花粉粒數為33，算得破壁率為67.34%。

2.5 冷凍時間對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖5可知，以冷凍時間為24 h最佳。在此冷凍條件下，可溶性總糖含量為27.62%，游離α.氨基氮含量為2.35%。通過此條件計算破壁率，在顯微鏡下觀察得到花粉粒總數為44，破壁花粉粒數為30，算得破壁率為68.18%。

2.6 水浴溫度對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖6可得，選擇45 ℃為最佳水浴溫度。測得可溶性總糖含量為38.07%，游離α.氨基氮含量為3.02%。通過此條件計算破壁率，在顯微鏡下觀察得到花粉粒總數為51，破壁花粉粒數為35，算得破壁率為68.63%。

2.7 正交試驗結果分析 在單因素試驗的基礎上，選取溫差、料液比、水浴時間、冷凍時間、水浴溫度各因素的最優試驗范圍，按照表1的因素水平表，選擇L16（53）正交表進行正交優化試驗，根據可溶性總糖、游離α.氨基氮的大小情況，確定檢測溫差破壁的最佳試驗條件。結果分析見表2所示。

從正交試驗結果可以看出，試驗的最優因素水平組合為A2B3C2D2E2，即選擇溫差為100 ℃，料液比為1∶7 g/ml，水浴時間為5 h，冷凍時間為24 h，水浴溫度為45 ℃作為接下來進一步試驗研究的反應條件，并測得在此條件下的破壁率為68.75%。

2.8 超聲波時間對山茶蜂花粉破壁的影響 將以最佳溫差破壁條件處理過的茶花粉進行超聲處理，所用儀器為超聲波清洗機，超聲波功率為220 W，對超聲時間進行單因素考察。

由圖7可得，超聲10 min時的可溶性總糖含量、游離α.氨基氮含量為最高，隨后逐漸降低并走向穩定。所以選擇10 min為最佳超聲波時間。在此超聲波條件下，可溶性總糖含量為46.08%，游離α.氨基氮含量為3.81%，在顯微鏡下觀察得到破壁蜂花粉粒數為42，蜂花粉總粒數為58，算得破壁率為72.41%。

3 結論

該研究根據單因素設計正交試驗，得出溫差破壁的最佳條件為溫差100 ℃，料液比1∶7 g/ml，水浴時間5 h，冷凍時間24 h，水浴溫度45 ℃。然后超聲處理10 min，破壁率為72.41%，可溶性總糖含量為46.08%，游離α.氨基氮含量為3.81%。

通過試驗驗證，此方法破壁效果比較好，可用于小規模生產。超聲波輔助技術是利用朝身邊輻射壓強產生的騷動效應、空化效應和熱效應加速物質的擴散溶解，該技術的低溫作用有利于保留熱敏成分、成本低、容易實現產業化等優點。

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責任編輯 李菲菲 責任校對 況玲玲