枇杷試管苗2個CAT基因成員的克隆及表達分析

李麗秀　賴鐘雄

摘 要 以早鐘6號枇杷試管苗葉片為試驗材料，采用同源克隆方法從葉片mRNA中分離得到CAT基因的2個成員Ej-CAT1和Ej-CAT2，Ej-CAT1 cDNA序列全長1 738 bp，包括1 479 bp ORF和257 bp 3′-UTR；Ej-CAT2序列全長1 742 bp，包含1 479 bp ORF及261 bp 3′-UTR。2個CAT基因成員的核苷酸序列相似性為98.04%，其開放閱讀框推導的氨基酸序列具有97.32%的相似性。生物信息學分析結果表明：2個蛋白均編碼492個氨基酸，是親水蛋白，不含信號肽，不存在螺旋卷曲結構，是非跨膜蛋白，亞細胞定位于過氧化物酶體；Ej-CAT1及Ej-CAT2蛋白分別有18、17個功能位點，22、19個磷酸化位點。CAT基因在枇杷試管苗離體保存過程中不同時期具有不同的表達量，整體趨勢呈“W”形狀，在離體保存1個月時表達量最高，保存7個月時表達量最低。CAT表達量變化可能跟枇杷試管苗的生長發育模式有關。

關鍵詞 枇杷；試管苗；CAT；基因克隆；表達分析

中圖分類號 S667.3 文獻標識碼 A

過氧化物酶（Hydrogen Peroxidase）又稱觸酶（CAT，Catalase），廣泛存在于動物、植物及微生物中。過氧化物酶是最早發現與植物種子活力有關的氧化酶之一[1]，能參與活性氧代謝過程，催化H2O2分解為H2O和O2，防止細胞過氧化；能催化分解甲酸鹽、亞硝酸及過氧化乙醇[2-6]。CAT能與SOD、POD組成活性氧防御系統，在植物防御、延緩衰老等方面起著重要作用，能夠控制細胞內的氧化還原平衡，與植物的抗旱、脅迫應答（耐鹽脅迫、耐溫度脅迫）、抗病及減輕重金屬等有關[7-8]。此外，CAT在食品工業、紡織、造紙、環保、醫藥等行業中得到廣泛應用[7-12]。

許多研究表明，CAT基因是多基因家族，不同成員在植物中的分布及功能有差異，具有組織差異性表達特點。1997年，Willekens等[12]從煙草中克隆得到3種CAT同工酶，并報道了cat1主要是清除光呼吸產生的H2O2，cat2可能特異的清除氧化脅迫產生的H2O2，而cat3主要是清除乙醛酸循環體中脂肪酸產生的H2O2。Shikanai[13]及Miyagawa[14]等報道了煙草葉綠體中的CAT表達增強了對光、干旱等氧化脅迫的抗性。John G等[15]報道了將CATs轉化其他物種，能提高植物對某些逆境的適應性。程華等[16]從銀杏中分離得到GbCAT1，其在葉、根、莖、果中均有表達，且表達量受滲透壓、ABA、紫外、溫度脅迫等影響。梁國慶等[17]研究發現高鈣處理12 h和低鈣處理24 h，蘋果CAT1基因表達量顯著增加，且不完全受鈣調控。王鳳德等[18]報道了豌豆CAT在煙草中的過量表達，提高了煙草的抗旱性及抗氧化性。齊興柱等[19]從香蕉中分離得到2個CAT基因，并發現其在氧化脅迫環境中起主要作用。林星谷等[20]從冬棗果實中分離得到ZjCAT基因，該基因在冬棗果實成熟衰老中具調控作用。楊芳[21]研究發現豌豆CAT轉化玉米提高了玉米的抗旱性。余迪求[22]發現過氧化氫酶在轉基因馬鈴薯中的過量表達，能提高馬鈴薯的抗病性。在南瓜中得到3個CAT基因成員，擬南芥也有3個CAT基因成員，小麥至少有3個CAT成員等。

目前CAT基因的研究領域涉及植物、動物及微生物，花椰菜、銀杏、蘋果、香蕉、冬棗、金絲桃、玉米、巴西橡膠、豌豆、小麥、番茄、甘蔗、蘿卜、南瓜、辣椒、水稻等植物[11，16-35]CATs基因均已被克隆出來，并做了相應的分析研究，但在枇杷上還未見報道。為了進一步研究CAT在枇杷試管苗離體保存以及其它生長發育過程中的作用，本試驗以枇杷試管苗為材料，采用同源克隆方法，從中克隆得到CAT基因的2個成員Ej-CAT1、Ej-CAT2的全長序列，并對其進行序列分析和結構預測；同時，對該基因在離體保存過程中6個不同時期的表達進行定量分析，為進一步研究其功能和調控途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

早鐘6號枇杷試管苗，由福建農林大學園藝植物生物工程研究所保存。選取生長旺盛的試管苗的葉片作為試驗材料。試管苗離體保存材料接種在1/3 MS+PP333的培養基上，取材時間分別為保存1、4、5、7、9及11個月。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計及合成 根據Gnebank上已登錄的其他物種CAT cDNA序列，設計保守區引物T1F、T1R；應用得到的保守區序列，設計3′端、5′端擴增引物P2F、P3F和P4R、P5R；根據拼接的cDNA全長序列，在其起始密碼子和終止密碼子處分別設計引物ORF-F、ORF-R，驗證開放閱讀框。定量表達分析的引物在CAT ORF內設計，設計的引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。各引物序列及其PCR擴增時所用參數見表1所示。

1.2.2 目的片段的擴增 以合成的cDNA第一鏈為模板，進行保守區擴增及3′ RACE；以cDNA第二鏈為模板，進行5′端擴增。PCR反應體系：cDNA模板1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，加ddH2O 9.5 μL至總體積25 μL。反應程序如下：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，按表1所示溫度退火1 min，72 ℃延伸t min[表1所示時間（t）]，從變性到延伸共35個循環，最后再72 ℃延伸10 min結束反應，

1.2.3 目的片段的回收、連接轉化及序列測定

用DNA回收試劑盒回收目的片段，將目的片段與PMD-18T載體連接并轉化DH5α感受態細胞，轉化產物涂在含有1 μL Amp ∶ 1 mL LB的平板中培養，12～16 h后挑起單菌落進行重組子菌液鑒定，陽性克隆子送到北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 用GenBank上的Blast檢索已有序列與分析其保守結構域，采用DNAMAN 6.0和primer 5.0軟件進行引物設計、序列拼接及翻譯氨基酸。用ExPASy（http：//www.expasy.ch/toos.html）數據庫中的ProtParam工具和ProtScale工具預測分析推測蛋白質的理化性質，蛋白質跨膜結構預測與分析采用TMPRED（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html），磷酸化位點預測用NetPhos2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos），利用MEGA 5.0構建系統進化樹。

1.2.5 熒光定量分析 將枇杷試管苗接種在1/3 MS+4.0 mg/L PP333+30 g/L白糖的培養基上，分別取保存時間為1、4、5、7、9、11個月的材料提取總RNA，按TaKaRa公司的PrimeScriptR RT reagent Kit說明書逆轉錄成cDNA。熒光定量以Actin基因為內參對照，在枇杷CAT基因最保守的地方設計引物，引物序列見表2。采用兩步法qRT-PCR，反應體系為SYBRR Primer Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O 7.4 μL。反應程序為，95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共40個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；40 ℃ 30 s。每個反應重復3次，以6個時期的cDNA混樣稀釋5倍梯度制作標準曲線，并得到各個Ct值，最終計算CAT基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 枇杷CAT基因保守區的克隆

以枇杷保守區cDNA為模板，用引物T1F、T1R進行保守區PCR擴增，得到2條731 bp的相似序列（圖1-A），與預期結果相符合，將其命名為CAT1、CAT2。經NCBI比對，發現CAT1、CAT2核酸序列與碧桃、甜櫻桃、葡萄、棗、楊樹、蓖麻、荔枝、龍眼等CAT的相似性均在80%以上，與碧桃的相似性在90%以上；CAT1、CAT2推導氨基酸序列與桃、棗、楊樹、李、葡萄、金絲桃等相似性在85%以上，故推斷CAT1、CAT2均是枇杷CAT基因的保守區序列。

經DNAMAN 6.0比對CAT1、CAT2核酸及氨基酸序列，結果見圖2。從圖2可知，兩核酸序列相似性為96.58%，在中間部位有25個不同堿基，氨基酸相似性為95.47%，含有11個不同氨基酸。

2.2 枇杷CAT基因的3′、5′末端的獲得與ORF分析

2.2.1 枇杷CAT基因的3′、5′末端的獲得 以保守區cDNA第一鏈為模板，將引物P2F、P3F與通用引物3P、3NP配對進行巢式PCR擴增。第二輪PCR擴增產物經膠回收、連接轉化及測序得到2條序列，其擴增產物電泳圖見圖1-B，序列長度分別為578、582 bp。經DNAMAN6.0 比對，發現得到的2條序列均與保守區序列有重疊部分，能夠拼接起來，故推斷2條序列均為枇杷CAT的3′序列。以5′cDNA為模板，用引物P4F、P4R多次克隆枇杷CAT的5′RACE，均未能得到序列，重新比對GenBank中其它物種的CAT基因序列后發現，CAT基因在起始密碼子處高度同源，故在CAT基因的起始密碼子處設計1條順式上游引物T5F，以5′cDNA為模板，T4F、T5F為引物進行PCR擴增反應，擴增得到1條750 bp左右的目的條帶（圖1-C）。測序得到1條722 bp大小的序列，與保守區序列拼接有一段高度重疊部分，說明得到的序列是CAT基因的5′端序列。

2.2.2 枇杷CAT基因ORF分析 將所得的5′端序列、保守區序列與3′端序列拼接起來，得到2條全長序列，分別命名為Ej-CAT1、Ej-CAT2，GenBank登錄號分別為：JX307086、JX307085。Ej-CAT1 cDNA序列全長1 738 bp，包括1 479 bp ORF及257 bp 3′-UTR，Poly（A）尾長19 bp；Ej-CAT2 cDNA序列全長1 742 bp，包括1 479 bp ORF及261 bp 3′-UTR，Poly（A）尾長23 bp。在Ej-CAT1、Ej-CAT2序列的起始密碼子和終止密碼子處各設1條引物，進行PCR擴增，擴增得到2條1 500 bp左右的條帶（圖1-D），經測序得到2條1 479 bp的相似序列，分別與Ej-CAT1、Ej-CAT2的開放閱讀框序列一致，進一步驗證了Ej-CAT1、Ej-CAT2序列的準確性。

2個CAT基因成員的核苷酸序列相似性為98.04%，其開放閱讀框推導的氨基酸序列具有97.32%的相似性。NCBI比對發現，2個CAT ORF序列與碧桃、甜櫻桃、棗、葡萄、毛果楊、橡膠樹、龍眼、棉花等其他物種的覆蓋度多在99%以上，相似性在80%以上。將CAT1、CAT2翻譯的氨基酸在線Blast，發現與碧桃CAT氨基酸的同源性為89%，與葡萄、棗、毛果楊、擬南芥的相似性分別為89%、88%、87%、83%，與其他物種的CAT氨基酸的相似性也在80%以上，屬于Catalase-like超級家族，由此判斷2個序列均為枇杷CAT的cDNA序列。

2.3 枇杷CAT的生物信息學分析

2.3.1 蛋白質的理化性質預測與分析 由預測結果可知Ej-CAT1蛋白翻譯492個氨基酸，分子總量為56 991.2，等電點pI為6.66，帶正電荷（Arg+Lys）與帶負電荷（Asp+Glu）氨基酸殘基總數分別為57、61。該蛋白含有20種氨基酸，其中Phe、Pro、Val 3種氨基酸的含量最多，均占7.1%；Cys、Met的含量最少，僅占全部氨基酸的1.2%。其分子式為C2 586H3 869N715O727S1，原子總數為7 909，不穩定指標為40.46，說明該蛋白是一個不穩定蛋白。其脂肪系數為71.71，總親水性值（GRAVY）為-0.520，預測該蛋白是親水蛋白。

Ej-CAT2蛋白分子總量為57 087.3，等電點為6.65，帶負電荷與帶正電荷氨基酸殘基總數分別為61、57。該蛋白的分子式為C2 594H3 869N715O727S12，原子總數為7 917，不穩定系數為41.57，是不穩定蛋白。其脂肪系數為70.33，總親水性值（GRAVY）為-0.539，說明該蛋白是一個親水性蛋白，而且親水性比Ej-CAT1蛋白的親水性強。該蛋白翻譯的492個氨基酸中共含有20種氨基酸，其中Phe、Pro兩種氨基酸的含量最多，占總氨基酸數的7.3%；Cys的含量最少，僅占1.0%，而且其含量低于Ej-CAT1蛋白中的Cys含量。

2.3.2 蛋白質親水性/疏水性預測 ProtScale分析Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白的親疏水性，預測結果顯示Ej-CAT1蛋白親疏水性值低于-2.000的氨基酸有36個，最低值為-2.722，位于第375氨基酸處；分值大于+2.000的氨基酸有4個，最大值為第326處氨基酸的+2.667，親水性氨基酸明顯大于疏水性氨基酸，預測該蛋白為親水性蛋白，與ProtParam工具的預測結果一致。

Ej-CAT2蛋白的預測結果顯示，親疏水性值低于-2.000的氨基酸有33個，最低值是第427氨基酸處，分值為-2.678；分值大于+2.000的氨基酸只有2個，分別位于氨基酸103與186處，其中186處氨基酸的分值最大，分值為+2.233，其親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，預測結果為親水性蛋白。

2.3.3 蛋白質的磷酸化位點預測 經NetPhos2.0 對枇杷Ej-CAT1蛋白、Ej-CAT2蛋白的磷酸化位點進行預測，結果見圖3。從圖3-A可知，Ej-CAT1蛋白的Ser、Thr和Tyr都存在磷酸化現象，共具有22個磷酸化位點，其中10個Ser位點，分別位于氨基酸10、14、70、85、104、112、164、347、437、491處；6個Thr位點，分別位于氨基酸97、115、273、292、351、414處；6個Tyr位點，分別位于氨基酸4、221、256、348、392、453處。從圖3-B中可知，Ej-CAT2蛋白共有19個磷酸化位點，其中9個Ser位點，分別位于第10、14、70、85、104、112、164、437、491個氨基酸；5個Thr位點，分別位于第97、115、273、292、351個氨基酸；5個Tyr位點，分別位于第4、221、256、392、453個氨基酸。推測2個CAT蛋白均是以Ser為主，Thr、Tyr為輔的方式。

與Ej-CAT1蛋白的相比，Ej-CAT2蛋白少了3個磷酸化位點，分別為第347氨基酸處的Ser位點，第414氨基酸處的Thr位點與第348氨基酸處的Tyr位點。

2.3.4 蛋白質功能位點預測 用ScaanProsite在線分析枇杷Ej-CAT1蛋白、Ej-CAT2蛋白的功能位點，結果顯示：Ej-CAT1蛋白含有18個功能位點，其中3個N端糖基化位點，蛋白激酶C磷酸化位點4個，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點有5個，酪氨酸磷酸化位點1個（386-392aa），N端豆蔻酰位點4個，酰胺化位點1個（414-417aa）。1個Catalase proximal heme-ligand singnature，1個Catalase proximal active site singnature。Ej-CAT2蛋白含有17個功能位點，其中3個N端糖基化位點，4個蛋白激酶C磷酸化位點，4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，1個酪氨酸磷酸化位點，4個N端豆蔻酰位點，1個酰胺化位點。1個Catalase proximal heme-ligand singnature，1個Catalase proximal active site singnature。

與枇杷Ej-CAT1蛋白功能位點相比，Ej-CAT2蛋白少了1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（347-350 aa），Ej-CAT2蛋白386-392 aa處酪氨酸磷酸化位點為Rde.Evd.Y，332-337 aa處N-豆蔻酰化位點為GvyySN，與Ej-CAT1蛋白有所不同。

2.3.5 蛋白質亞細胞定位預測 用PSORT對Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白亞細胞定位進行預測，發現2個CAT蛋白定位于過氧化物酶體的可能性較大，分值為0.748；其次是線粒體基質，分值為0.100。而Ej-CAT1、Ej-CAT2 蛋白信號肽及跨膜結構預測表明，2個蛋白均是非分泌蛋白，不含跨膜結構，是非跨膜蛋白。

2.3.6 蛋白質結構預測 PSIPRED軟件預測表明Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白的二級結構是由α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲3種結構組成，其中無規則卷曲所占的比例較大，α-螺旋、β-折疊所占比例相當。枇杷CAT兩個蛋白的二級結構并沒有顯著差異，只有兩個細微差異。Ej-CAT2蛋白在氨基酸349-355處、475處形成α-螺旋，而Ej-CAT1蛋白則沒有形成α-螺旋。GOR4軟件預測結果與PSIPRED預測結果類似，Ej-CAT1二級結構中無規則卷曲占59.55%，α-螺旋占18.50%，β-折疊占21.95%；枇杷Ej-CAT2二級結構中無規則卷曲占59.76%，α-螺旋占16.46%，β-折疊占23.78%。

利用SWISS-MODEL工具對Ej-CAT1、Ej-CAT2蛋白的三級結構進行在線預測，預測結果如圖4所示。兩個CAT蛋白的三級結構基本相似，主要是由無規則卷曲，α-螺旋，β-折疊組成。

2.3.7 蛋白質系統進化樹的構建 經NCBI BLASTn比對后，發現2個枇杷CAT氨基酸與碧桃（Prunus persica）、棗（Ziziphus jujuba）、毛果楊（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、甜櫻桃（Prunus avium）、貫葉金絲桃（Hypericum performatum）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、胡麻（Sesamum indicum）、煙草（Nicotiana benthamiana）、荷花（Nelumbo nucifera）、木欖（Bruguiera gymnorhiza）、冰葉日中花（Mesem-bryanthemum crystallinum）、甜椒（Capsicum annuum）、木薯（Manihot esculenta）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、馬蹄蓮（Zantedeschia aethiopica）、蘿卜（Raphanus sativus）、蕓薹（Brassica juncea）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）的相似性分別均在80%以上。將枇杷兩個CAT成員與這22個氨基酸進行分子進化樹的構建，結果見圖5。從圖5可見，整個進化樹分成2個組群，水稻屬于小組群，Ej-CAT1、Ej-CAT2與其余的植物均屬于大組群。Ej-CAT1、Ej-CAT2與葡萄、碧桃、甜櫻桃、木薯、小麥同處一小分支，有著很近的進化關系；與甜椒、荷花、馬蹄蓮、玉米有著相對較遠的進化關系，與水稻cat-c的進化距離最遠；與其他植物有著相對較近的進化關系。

2.4 枇杷試管苗離體保存過程中CAT基因的相對定量表達分析

由Real Time PCR反應得到的CAT及內參基因Actin基因的溶解曲線，均只出現1個單峰。從擴增曲線圖上看，兩個基因的曲線拐點清楚，指數期明顯，整體平行性較好，表明CAT及Actin基因的引物特異性較好。制作的標準曲線結果顯示，枇杷CAT和內參基因Actin的標準曲線線性范圍較廣，起始模板稀釋倍數相關系數與Cq值良好。CAT及Actin標準曲線的擴增效率分別為1.933、1.958，標準曲線的斜率均在-3.4～-3.6 之間。綜上，這兩個基因的引物特異性良好，符合試驗要求，可進行下一步試驗。

6個不同時期材料進行qPCR，得到所有Ct值，計算各時期的相對表達量，結果見圖6。CAT基因在6個不同保存時期都有表達，表達量的整體趨勢呈字母“W”形狀。保存1個月時，表達量最高；到保存4個月時，表達量急劇下降，其表達量僅是保存1個月時表達量的1/3；保存5個月時表達量稍微升高，到保存7個月時表達量又開始下降；保存9個月時，該基因表達量迅速上升，其表達量是保存7個月表達量的2倍；而保存9個月、11個月的表達量沒有明顯變化，表達相對穩定。

3 討論與結論

3.1 枇杷CAT蛋白功能多樣性

枇杷葉片兩個CAT成員的氨基酸序列與多種植物的CAT蛋白氨基酸序列的相似性均在80%以上。在CAT氨基酸進化樹分析中，枇杷不同CAT蛋白與葡萄、碧桃、甜櫻桃、木薯、聚類在一起，與水稻cat-c的進化距離最遠。根據生物學信息分析結果，枇杷葉片不同CAT成員均不含跨膜結構，不含信號肽，沒有卷曲螺旋結構，是不穩定的親水蛋白。亞細胞定位于過氧化物酶體，能與SOD、POD組成活性氧防御系統，參與活性氧代謝過程，催化H2O2分解為H2O和O2，能控制細胞內的氧化還原平衡，在枇杷試管苗離體保存中的植物防御、延緩衰老等方面起著重要作用。潛在磷酸化預測結果顯示，CAT1蛋白具有22個磷酸化位點，CAT2蛋白有19個磷酸化位點，2個CAT成員均是以絲氨酸為主，酪氨酸、蘇氨酸為輔的方式，調控枇杷試管苗離體保存中的信號轉導及基因表達等活動。蛋白質功能的預測結果顯示：CAT1和CAT2分別有18、17個功能位點，其中分別具有3個N-糖基化位點，4個蛋白激酶C磷酸化位點，4個N-豆蔻酰位點，1個酰胺化位點，5或4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，CAT1蛋白比CAT2蛋白多了1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。這些均說明了枇杷CAT含有多種蛋白質翻譯后修飾方式[36]，其在枇杷體內擁有不同的功能作用。

枇杷2個CAT成員的氨基酸序列具有97.36%的相似性，擁有部分相似的功能和結構，但2個CAT蛋白還存在不同的結構與功能，因此，枇杷CAT兩個成員可能在枇杷試管苗離體保存中相互協調、各自分工的方式來發揮作用。

3.2 枇杷CAT基因在試管苗離體保存中的作用

CAT對H2O2具有親和力，能夠在各種脅迫下清除多余的H2O2，防止形成羥自由基。CAT是多基因家族，其表達受到發育和環境等因素影響[33]，且不同基因成員的表達具有時空差異。程華等[16]認為銀杏CAT基因的表達受到ABA、滲透壓及溫度等環境因素的影響。

枇杷試管苗離體保存過程中，各個時期CAT基因的表達量不同，在培養基中加入植物生長抑制劑PP333，保存1個月時CAT基因表達量最高，之后保存4個月、5個月及7個月的表達量均有所回落，在保存9個月和11個月時表達量又上升到一定水平。高表達量的CAT能夠有效減少試管苗體內的活性氧積累，維持植物的生理代謝，能夠延緩衰老。試管苗保存1個月時，枇杷試管苗葉片慢慢發育成熟，此時會有大量的活性氧產生，高表達CAT能夠減少活性氧積累，降低氧化傷害。在之后的幾個月，CAT基因的表達量減少，可能跟試管苗側芽抽出新的嫩葉有關。到保存9個月、11個月時，CAT基因表達量維持在一定程度，可能是試管苗大部分枝葉進入成熟和衰老階段，培養基中PP333也能夠有效的控制植物的衰老，一大部分減少了植物體內一些活性氧的積累。枇杷CAT基因在整個離體保存中表達量不斷變化，推測其在試管苗離體保存中起著重要的作用。

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