慢性氟中毒誘發大鼠肝臟損傷機制的研究

蒙光義　王冬曉　王緝義等

摘要：目的 探討氟化鈉慢性中毒對大鼠肝臟生化功能的影響及其相關機理。方法 通過給大鼠自由飲用含有不同劑量氟化鈉自來水3個月，制備慢性氟中毒模型，測定其血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活性水平，同時檢測各組大鼠肝臟總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）的活力含量。結果 氟化鈉慢性中毒各組尿氟和血氟含量均比正常對照組增高（P<0.01），并且中、高劑量組大鼠血清ALT、AST活性增高（P<0.01）；氟化鈉各組大鼠肝臟MDA含量均顯著高于正常對照組（P<0.01），S0D和T-AOC活性顯著下降（P<0.01），同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01）。結論 氟化鈉慢性中毒能夠引起肝臟損傷，氧化應激引起的氧化損傷作用可能是氟致大鼠肝損傷的重要原因之一。

關鍵詞：氟化鈉；慢性中毒；肝損傷；氧化應激；脂質過氧化；大鼠

長期以來，氟中毒主要損害牙齒、骨骼等骨性組織已十分明確，而對內臟的損害卻未能引起臨床學和病理學醫生的重視。氟是機體重要的微量元素之一，但攝入過量能引起廣泛的全身性病變，其作用機理至今尚不清楚。隨著自由基醫學的發展，人們越來越多的發現自由基與許多疾病的發生密切相關。研究表明，造成肝臟組織損傷是氟中毒引起的非骨相損害的重要靶器官之一，人群流行病學調查和動物實驗均表明氟中毒可引起肝臟組織結構和功能異常[1]，其損傷機制目前尚不明確。大量研究結果表明，氧化應激在氟中毒對機體的損傷中起著重要作用[2，3]，機體慢性氟中毒時內臟組織病理損傷可能與氟誘導機體脂質過氧化作用增強有關[4]，但脂質過氧化在氟中毒肝臟損傷中的作用機制有待進一步研究。本實驗通過制備大鼠氟化鈉慢性中毒模型，檢測氟中毒大鼠血清中谷丙轉氨酶（GPT）和谷草轉氨酶（GOT）的活性，并觀察肝臟脂質過氧化產物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）含量的變化，進一步探討肝損傷與脂質過氧化之間的關系，為深入研究氟中毒肝臟病變提供科學依據。

1 資料與方法

1.1實驗動物 Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，體重（100±10）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYKG桂2003-0005。動物室溫度：（25±2）℃，相對濕度：（60±2）%。動物以廣西醫科大學醫學實驗動物中心配制的飼養。

1.2主要藥品和試劑 氟化鈉（北京化工廠生產，分析純，批號：20090703）。谷丙轉氨酶測定試劑盒（批號：20091114），谷草轉氨酶測定試劑盒（批號：20091114），總抗氧化能力測定試劑盒（批號：20090918），丙二醛測定試劑盒（批號：20090918），超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：20090905），谷胱甘肽測定試劑盒（批號：20090905），考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號：20050723）測定，均為南京建成生物工程研究所產品。

1.3主要儀器 電熱恒溫水浴（北京長安科學儀器廠）；低溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；722S分光光度計（南京建成生物工程研究所（北京長源實驗設備廠）；漩渦混合器XW-80A（上海醫科大學儀器廠）；電子天平（上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠）。

1.4動物分組 健康Wistar大鼠60只，隨機分為四組，每組15只，分別分為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組電針治療組。其中低、中、高劑量組大鼠分別自由飲用有含氟化鈉55、110、222mg/L的煮沸冷卻自來水，空白對照組大鼠自由飲用煮沸冷卻自來水。給藥期間稱體重1次/2w，并觀察一般狀況，有無死亡等情況，實驗周期共3個月。

1.5指標觀察與測定 實驗結束后收集24h尿，以待測定尿氟，各組摘除大鼠眼球取血，靜置后3000r/min離心15min分離血清，采用采用氟離子選擇電極法測定尿氟、血氟含量；同時按試劑盒說明，采用賴氏法測定血清ALT和AST活性。頸椎脫臼處死大鼠，取肝臟左葉剪碎后加入9倍生理鹽水在冰浴中制成10%（W/V）肝勻漿組織液，3000r/min離心15min分離上清液，于-20℃保存待測。分別比色法測定肝組織中T-AOC活力、硫代巴比妥酸染色法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和二硫代雙硝基苯甲酸法測定GSH含量，考馬斯亮藍法檢測肝臟組織蛋白，均采用南京建成生物工程研究所產品試劑盒，嚴格按照均按照說明書操作測定。

1.6數據統計 統計計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，所有數據均在計算機中由SPSS13.0統計軟件處理。

2 結果

2.1一般狀況 空白對照組和低劑量組大鼠活動正常，體重增長正常，毛色光澤；而中、高劑量組大鼠安靜少動、體重體重增長率隨染毒劑量增加呈降低趨勢，飲水量偏多，部分大鼠毛色無光澤。空白對照組大鼠門牙呈棕黃色，表面色澤光滑；中、高劑量組所有大鼠門齒均有白堊，表面粗糙，光澤偏黃色，重者甚至發生牙齒缺損。實驗期間，正常對照組雌性大鼠死亡1只；中劑量組雄性大鼠死亡2只；高劑量組雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡1只。

2.2氟化鈉慢性中毒大鼠尿氟、血氟含量變化 實驗結果顯示，3個月后氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量顯著高于正常對照組（P<0.01），表明氟化鈉慢性中毒模型建立成功。而且隨著染氟劑量增加，尿氟和血氟含量也增高，具有劑量-反應關系，見表1。

2.3氟化鈉慢性中毒大鼠血清轉氨酶變化 實驗結果顯示，與正常對照組相比，氟化鈉中、高劑量組大鼠AST、ALT活性水平顯著升高（P<0.01），表明慢性中毒過程中氟化鈉誘發大鼠肝臟損傷，見表2。

2.4氟化鈉慢性中毒大鼠肝臟脂質過氧化的改變 實驗結果顯示，給予氟化鈉3個月后，氟化鈉各個劑量組大鼠肝臟中脂質過氧化產物MDA具有顯著性增高（P<0.05、P<0.01），且與劑量的增加呈現一定的正比關系；而SOD和T-AOC隨著氟化鈉劑量的增加而顯著性降低（P<0.05、P<0.01），表明機體抗氧化能力作用減弱。同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01，P<0.05），見表3。

3 討論

本實驗采用含不同劑量氟化鈉的煮沸冷卻自來水喂飼大鼠3個月后，氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量均顯著高于正常對照組（P<0.01），表明成功地復制氟化鈉慢性中毒大鼠模型。肝臟是機體的主要解毒器官，催化氨基轉移作用的轉氨酶在肝臟中含量豐富，當肝臟有損傷時，酶可以由損傷的細胞釋放入血中，使血液中轉氨酶活性顯著增高。ALT、AST均為非特異性功能酶，正常時血清的含量很低，但當肝受損時，肝通透性增加，胞漿內的AST、ALT釋放入血漿，致使血清AST、ALT的酶活性升高[5]。酶活性的高低變化與肝細胞受損的程度相一致，所以常作為肝功能檢測的敏感指標，此外，二者均可導致微粒體鈣泵活性降低，使胞質Ca2+含量升高，細胞內Ca2+穩態遭到破壞，從而引起細胞代謝紊亂甚至死亡。目前國內外有關氟與細胞凋亡的研究大多采用了流式細胞術方法，井鈴等[6]應用流式細胞術發現加氟組大鼠肝臟凋亡百分率較對照組明顯升高，證明了氟可導致大鼠肝細胞凋亡。本實驗結果顯示氟化鈉中、高劑量組大鼠血清AST、ALT活性明顯升高（P<0.01），說明氟中毒誘導了大鼠肝細胞凋亡，提示氟化鈉慢性中毒能夠誘發大鼠肝損傷，并且損傷程度與氟化鈉劑量呈現一定的劑量關系。

目前，地氟病發病機理尚未能夠明確闡明，氧化應激引起的自由基代謝紊亂損傷在地氟病中的一直是研究熱點。在正常情況下，體內氧自由基的產生和清除是平衡的，當氧自由基產生過多或抗氧化體系出現故障，體內氧自由基代謝就會出現失衡，或稱氧化應激[7，8]。活性氧自由基可以與機體內多種生物分子發生反應，破壞正常組織的結構和功能，造成組織細胞生物膜、蛋白質、核酸等損傷。如氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，最終生成產物為MDA。因此，MDA的測定常常與SOD相互配合，MDA的高低間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，SOD活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力，保護細胞免受氧自由基損傷，通過SOD和MDA的結果分析就可以知道機體內氧化應激的情況。有研究報道自由基或其脂質過氧化產物易穿透核膜而直接損傷DNA，使凋控基因（P53、Bcl-2）等遭到破壞，干擾細胞生長和死亡的平衡，導致細胞發生凋亡[9]。本實驗結果表明，本實驗結果顯示氟化鈉各個劑量組與正常對照組相比MDA含量明顯增高（P<0.01），而SOD活性顯著降低（P<0.01），同樣，T-AOC和GSH也均顯著性下降，表明機體吸收過量的氟后肝臟組織過氧化作用增強，使機體處于氧化應激狀態，抗氧化能力下降，造成機體氧化與抗氧化防御機制之間的失衡，這與相關文獻報道相一致[1]。

本實驗結果顯示，機體攝入過量的氟后，體內自由基代謝紊亂，造成機體內過氧化作用增強和抗氧化能力降低，與肝損傷具有密切的相關性。同時也為證明氟中毒的自由基學說提供了有力的證據。總而言之，氟化鈉慢性中毒能夠引起肝臟損傷，氧化應激引起的自由基化損傷作用很可能是氟化鈉致大鼠肝損傷的重要原因之一，本研究結果為預防和治療地氟病患者提供了科學依據。

參考文獻：

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編輯/哈濤