生防枯草芽孢桿菌B579芽孢形成關鍵基因的研究

（天津生物工程職業技術學院，天津 300462）お

摘要 ［目的］克隆生防菌芽孢形成關鍵基因玸po0A啟動子P玸po0A，并檢測其特性。［方法］從生防菌B579 DNA中，經PCR擴增芽孢形成關鍵基因玸po0A啟動子P玸po0A，插入載體pGFP，構建重組表達質粒pGFP睵玸po0A。［結果］重組表達質粒經雙酶切和PCR鑒定，證明構建正確，測序，結果與GenBank中的序列同源性為98%。［結論］該方法獲得了含有綠色熒光蛋白基因和芽孢形成關鍵基因玈po0A的重組質粒，為進一步研究生防菌B579芽孢形成規律奠定了基礎。

關鍵詞 生防菌；枯草芽孢桿菌；芽孢

中圖分類號 SB188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06152-03

お

The Research of Spore Form Key Genes of Biocontrol 獴acillus subtilis B579

JIA Jun瞙ui

(Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300462)

Abstract ［Objective］ To clone and express the promoter of spore form key genes of 獴acillus subtilis and determine the property of expressed product. ［Method］ The promoter of spore form key genes spo0A of 獴. subtilis was amplified from chromosome DNA of 獴. subtilis by PCR and inserted into vector pGFP. The constructed recombinant secretory expression vector pGFP睵spo0A was transformed to B579 by Electrotransformation. ［Result］ Both restriction analysis and PCR proved that recombinant plasmid pGFP睵spo0A was constructed correctly. Sequencing result proved that the homology of nucleotide sequence of target gene was 98% to that reported in GenBank. ［Conclusion］ The study will lay a foundation for further study form law of biocontrol bacterium B579.

Key words Biocontrol bacterium; 獴acillus subtilis; Spore

お

作者簡介 賈鈞輝（1986- ），男，天津人，碩士研究生，研究方向：微生物制藥。

收稿日期 20140528

枯草芽孢桿菌是一種好氧、產芽孢、桿狀的革蘭氏陽性細菌，對人畜無毒無害，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。許多性狀優良的枯草芽孢桿菌生防菌株已經進行溫室或大田防治研究，對黃瓜［1］、辣椒［2］、水稻［3］、小麥［4］等農作物病害顯出較好的防治效果。枯草芽孢桿菌在發酵過程中有生成芽孢的特性，芽孢的大量生成會嚴重影響一些目的產物的生產和高濃度菌體的獲得。因此，在發酵中前期應嚴格控制發酵條件，及時檢測菌體生長狀態，預防過早生成芽孢，而在發酵后期應促進芽孢的生成，從而有利于高芽孢濃度菌劑的制備［5］。對于芽孢的形成就目前的研究進展來看，主要是獳brB蛋白和spo0家族基因。spo0家族基因包括很多，如，spo0A，spo0B，spo0F等。spo0A是進入芽孢階段重要的轉錄調控因子，是DNA復制的抑制劑［6］。孢子形成的起始被一個復雜集合體-蛋白激酶，磷酸化蛋白和磷酸酯酶所控制的。多組分物質的磷酸化允許輸入和多重集合，不連續的新陳代謝和環境因子。這個信號轉導系統輸出的決定性是玈po0A轉錄因子的磷酸化。

課題組前期研究中篩選到的枯草芽孢桿菌B579，對多種常見的土傳病害表現出明顯防治效果［7］，具有良好的應用前景。筆者利用基因工程技術對B579芽孢形成的關鍵基因進行分析，獲得了含有綠色熒光蛋白基因和芽孢形成關鍵基因玈po0A的重組質粒，以期為進一步研究生防菌B579芽孢形成規律奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種及載體。供試菌種為枯草芽孢桿菌（獴acillus subtilis）B579，質粒為pUC18和pGFP。

1.1.2 主要試劑。限制性內切酶Xba I和EcoR I、pfu聚合酶、T4DNA連接酶、DNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒和DNA marker，均由北京全式金生物技術有限公司提供；膠回收試劑盒，由北京天恩澤基因科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成。根據NCBI報道的枯草芽孢桿菌獴acillus subtilis subsp.玸ubtilis str.168 玸po0A基因序列（Gene ID：938655），分析其啟動子P玸po0A，開始設計1對特異性擴增引物，上游引物5端加有玐ba I酶切位點，下游引物5端加有獷co玆 I酶切位點：P玸po0A1：5睺GCTCTAGAGTTTCTTCCTCCCCAAATGTAGTTAACAGGA3，下劃線為玐ba I酶切位點；P玸po0A2：5睠CGGAATTCACTGCCGGAGTTTCCGGCAGT睺TTTTTATTTTGA3，下劃線為獷co玆 I酶切位點。引物交由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.2 目的基因的擴增。按DNA提取試劑盒說明書提取枯草芽孢桿菌的基因組DNA，以總基因組為模版進行PCR擴增。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃復性20 s，72 ℃延伸15 s，共循環30個循環，72 ℃再延伸10 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3

重組表達質粒pGFP睵玸po0A的構建。將純化后的PCR產物和載體pGFP78分別經玐ba I和獷coR I雙酶切，膠回收目的基因片段和載體片段，經T4 DNA連接酶16 ℃連接12 h，構建重組表達質粒pGFP勃玃spo0A，利用電轉化法進行┳化。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌B579基因組DNA的提取 枯草芽孢桿菌B579（獴acillus Subtilis B579）基因組DNA質量的好壞直接影響獲取玸po0A基因啟動子（P玸po0A）的質量。因此，取3 ml枯草芽孢桿菌B579（進入對數期）菌液進行基因組DNA的提取，根據電泳圖1顯示，基因組DNA條帶單一，提取完整，并無降解，無雜質，無拖尾，獲得了質量較好的基因組DNA。

注：M：玊rans15K DNA Marker；1：The genomic DNA。

圖1 枯草芽孢桿菌B579基因組DNA

2.2 玸po0A序列分析 根據NCBI報道，玸po0A基因803 bp。將所測序列與GenBank數據庫中的序列進行Blast，與GenBank已公布的枯草芽孢桿菌獴acillus subtilis168 玸po0A基因兩者相似性分別為97%。因此，說明B579中具有玸po0A基因（圖2）。

注：M：玊rans2K㏕M Plus DNA Marker；1：玸po0A基因 PCR 產物。

圖2 玸po0A基因PCR產物

2.3 玸po0A基因在發酵過程中表達量的分析 取發酵過程中6、8、10 h培養的枯草芽孢桿菌，采用RT睵CR法檢測玸po0A基因在發酵不同時間的表達量。圖3、5表明，發酵過程中玸po0A基因的表達量是不同的，隨發酵過程時間增加，所檢測到的C璗逐漸增大，表征為玸po0A基因的表達量。通過對芽孢形成規律的研究，玈po0A磷酸化是芽孢形成最初始的信號。根據發酵過程活菌及芽孢計數，枯草芽孢桿菌在這個時期進入到芽孢形成的初始階段，在此階段進行芽孢形成的干預應具有明顯效果。

圖4表明，玸po0A基因引物的特異性很好。在引物溶解曲線中只出現一個單獨的尖峰，說明引物特異性好，根據以上結果可知，在發酵過程6~10 h，玸po0A基因表達量與芽孢數量呈正相關。

圖3 RT睵CR檢測枯草芽孢桿菌玸po0A基因表達量

圖4 玸po0A基因引物溶解曲線

圖5 C璗值隨時間變化曲線

2.4 玸po0A基因啟動子的克隆 根據NCBI報道，玸po0A基因啟動子（P玸po0A）全長294 bp。以枯草芽孢桿菌B579的基因組DNA為模板，通過PCR，擴增玸po0A基因啟動子。圖6表明，PCR擴增產物亮度明顯，在300 bp左右出現特異性條帶，其大小與玸po0A基因啟動子（P玸po0A）294 bp大小基本一致，說明PCR擴增結果正確。

注：M：玊rans2K㏕M Plus DNA Marker；1：玸po0A基因啟動子 PCR ┎物。

圖6 玸po0A基因啟動子PCR產物

2.5 克隆載體的構建 利用pfu聚合酶得到的玸po0A基因啟動子（玃spo0A）片段為平末端片段，純化后的片段直接與pGFP78平末端克隆載體連接。挑取單菌落培養，按照質粒小提試劑盒步驟從單克隆菌液中提取質粒，進行PCR擴增及對重組質粒進行雙酶切驗證。鑒定正確的克隆載體，交由上海生工生物工程技術有限公司測序。

圖7為重組克隆質粒PCR驗證結果，圖7的第1泳道是以重組質粒pGFP睵玸po0A為模板的PCR反應，得到了一條大小在300 bp左右的條帶，大小與圖7中PCR產物大小結果相符。圖8為重組克隆質粒pGFP睵玸po0A雙酶切驗證結果，圖中

注：M：玊rans Mark I DNA Marker；1：pGFP睵玸po0A PCR。

圖7 重組克隆質粒pGFP睵玸po0A PCR驗證

注：M：玊rans2K㏕M II Plus DNA Marker；1：pGFP睵玸po0A / Eco玆 I /玐ba 獻。

圖8 重組克隆質粒pGFP睵玸po0A雙酶切驗證

顯示從pGFP睵玸po0A上切下一條大小為300 bp左右的片段，大小與PCR結果相符，另一條4 800 bp左右大小的條帶與空質粒大小一致，說明克隆載體pGFP睵玸po0A構建┏曬Α＊

2.6 玸po0A 基因啟動子序列分析將所測序列與GenBank數據庫中的序列進行Blast，與GenBank已公布的枯草芽孢桿菌獴acillus subtilis168 玸po0A基因啟動子兩者相似性為98%。

3 結論與討論

試驗以枯草芽孢桿菌B579基因組DNA為模板，擴增得到芽孢形成基因啟動子P玸po0A，其長度與NCBI上報道的玸po0A啟動子大小相同，均為294 bp。將P玸po0A連接到pGFP78上，構建pGFP睵玸po0A重組質粒。通過測序驗證質粒構建成功。此重組質粒可以為枯草芽孢桿菌快速檢測芽孢形成提供基礎。以枯草芽孢桿菌B579 RNA為模版，通過反轉錄，得到cDNA，RT睵CR檢測芽孢形成關鍵基因玸po0A的表達量，結果表明在發酵過程前期（6~10 h）中，隨發酵過程的進行，玸po0A的表達量與芽孢數量呈正相關。該結論為進一步研究提供了重要的理論依據。

參考文獻

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