蘿卜清除DPPH自由基活性研究

段艷波 蔣福宇 高品一 劉學貴

(沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧沈陽 110142)お

摘要

［目的］研究蘿卜清除DPPH自由基的活性。［方法］通過對蘿卜葉水提物、水提物不同極性部位萃取物、蘿卜中脂肪油類有效成分β補如藪冀行清除DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基活性測試，對蘿卜的抗氧化能力進行評價。［結果］以檸檬酸為對照其清除能力大小順序為：乙酸乙酯層 >二氯甲烷層>蘿卜葉水提物>β補如藪>石油醚層>檸檬酸。［結論］蘿卜具有較好的抗氧化能力。

關鍵詞 蘿卜葉水提取物；不同極性部位萃取物；β補如藪跡籇PPH自由基

中圖分類號 SB188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06155-02

お

Research on DPPH Free Radical Scavenging Activity of Radish

DUAN Yan瞓o, LIU Xue瞘ui et al

(College of Pharmaceutical and Biological Engineering, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang, Liaoning 110142)

Abstract ［Objective］ To study DPPH free radical scavenging activity of radish. ［Method］ This paper clears testing DPPH (1,1瞕iphenyl3瞡itrophenylhydrazine) free radical scavenging activity of the different polarities of water extracts from Radish leaves and the compound of β瞫itostero by isolating from radish. ［Result］ Using citric acid as standard, the order of the scavenging ability is ethyl acetate layer > dichloromethane layer >radish leaf extract > sitosterol > petroleum ether layer> citric acid. ［Conclusion］ Radish has a good antioxidant capacity.

Key words Radish leaf extract; Different polar parts; β瞫itostero; DPPH free radical scavenging

お

作者簡介

段艷波(1991-)，男，內蒙古赤峰人，本科，專業：天然藥物化學。*通訊作者，副教授，博士，從事天然產物及其衍生物的活性和制備工藝研究。

收稿日期 20140606

蘿卜（玆aphanus sativus 獿.）又名菜菔、蘆菔、菜頭、雹突等，為十字花科蘿卜屬（玆aphanus）1年或2年生的草本植物，在我國具有悠久的食品和藥品的使用歷史［1］。據國內外文獻報道，蘿卜中的化學成分主要有生物堿、黃酮、三萜皂苷、脂肪油、揮發油、硫代葡萄糖苷酯、有機酸和多糖等［2-3］。蘿卜成熟的種子、根、葉中的有效成分均有很好的藥用價值。研究顯示，蘿卜具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、降壓、止咳化痰、止血、利尿和增加小腸的蠕動等藥理作用［4-12］。蘿卜的產量大、種植栽培技術成熟，且容易貯存，是具有廣泛應用價值的藥食兩用植物。

DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基是合成的一種穩定的氮中心的自由基，主要由于其3個苯環的共軛穩定作用及空間障礙，導致氮原子電子不能與電子成對。清除DPPH自由基試驗的原理為清除劑和DPPH自由基孤對電子配對，使紫色消失變為黃色，在紫外517 nm波長處測得的吸光度變小，清除劑的清除能力越強吸光度越小（圖1）。因為其結構簡單并且容易控制反應，所以清除DPPH自由基是現今抗氧化活性評價和篩選應用最廣泛的方法之一［13-15］。筆者以檸檬酸為對照品，對蘿卜葉水提物、水提物不同極性部位萃取物、蘿卜中脂肪油類的有效成分β補如藪冀行清除DPPH自由基活性研究，對蘿卜的抗氧化能力進行評價，以期為蘿卜抗氧化活性成分的跟蹤分離研究提供試驗依據。

圖1DPPH自由基結構及作用原理

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1

研究對象。白蘿卜葉，產地遼寧省沈陽市，經鑒定為蘿卜（玆aphanus sativus 獿.）的新鮮葉。

1.1.2

主要儀器。RE5205旋轉蒸發器，購自上海亞榮有限公司；TD5102電子天平，購自余姚市金諾天平儀器有限公司；GZX睤(Ⅲ)循環式真空水泵，購自鞏義市予華儀器有限責任公司；UV3系列紫外可見分光光度計，購自上海光譜達儀器有限公司；HZC超聲波清洗器，購自福州志科學儀器有限公司。

1.1.3

主要試劑。DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼），購自TCI公司；檸檬酸，購自天津是永大化學試劑有限公司；抗壞血酸，購自中國國藥化學試劑公司；其他試劑均為分析純，購自中國國藥化學試劑公司。

1.2 方法

1.2.1

總提物及其不同極性部位萃取物的制備。將采集的蘿卜葉晾干，取干燥的蘿卜葉放入水浴鍋中，在20 ℃條件下水浴提取18 h，提取完畢，過濾，收集濾液。取濾液500 ml，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯1 000 ml，萃取3次，萃取完畢，旋蒸，揮干，制得,3個極性部位萃取物的浸膏，待用［16］。

1.2.2

DPPH自由基儲備液的配置。準確稱取DPPH粉末置于15 ml EP管中，量取10 ml無水乙醇加入EP管中配置得到2 mmol/L的DPPH儲備液。取1 ml儲備液加9 ml無水乙醇置于15 ml EP管得到0.2 mmol/L的DPPH待用。

1.2.3

樣品儲備液及其濃度梯度的配置。準確稱取樣品粉末（石油醚組分、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、蘿卜葉水提物、β補如藪肌⒛檬酸）5 mg置于15 ml EP管中，量取10 ml濃度70%無水乙醇加入EP管中，配置得到0.5 mg/ml的樣品儲備液；再用濃度70%無水乙醇將7種樣品儲備液分別稀釋至質量濃度梯度為1.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 │蘥/ml，得到試驗樣品。

1.2.4

DPPH自由基最大波長的確定。對0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液在350~800 nm范圍進行波長掃描［17-18］，考察最佳測定波長。

1.2.5

DPPH自由基穩定性試驗。用0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液與0.04 mmol/L的抗壞血酸混合，在波長517 nm處監測其吸光度，每隔2 min記錄1次，建立吸光度(玒)與時間(X)的關系。お

1.2.6

清除DPPH自由基試驗。配置蘿卜葉不同極性段樣品質量濃度梯度（1.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 μg/ml）和0.2 mmol/L的DPPH。樣品組：用移液槍準確移取100 μl的DPPH和100 μl不同濃度梯度的樣品置于96孔板孔中，避光反應40 min，在517 nm下測其吸光度值為獳璱。樣品本底組：準確移取100 μl的樣品和100 μl的無水乙醇，其吸光度值為獳璲；空白對照組：準確移取100 μl的DPPH和100 μl的無水乙醇，其吸光度值獳璫。每組進行3次平行試驗。DPPH自由基清除率計算公式如下：

清除率=1-獳璱-A璲 A璫×100%オ

根據不同濃度梯度的樣品對DPPH自由基的清除率，繪制6種不同樣品對DPPH自由基的清除率曲線，并對各曲線進行線性擬合，得到6種不同樣品的獻C50值［20］。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基最大波長的確定

結果顯示，DPPH自由基約在517 nm處有最大吸收峰。

圖2 0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液全波長掃描結果

2.2 DPPH自由基穩定性試驗

圖3表明，0~2 min隨時間變化吸光度呈線性迅速下降；2~35 min后變化很小，吸光度趨近于穩定狀態，35 min后吸光度基本無變化。因此，由DPPH自由基穩定性試驗可以確定，為了提高清除DPPH自由基測試精確性，在加入樣品反應35~40 min后測量反應物吸光度［19］。

圖3DPPH自由基穩定性試驗

2.3 樣品的DPPH自由基清除曲線

圖4表明，各樣品對DPPH的清除率接近指數關系，在樣品濃度梯度較低時清除率隨著濃度增加近似為線性關系，而濃度較大時清除率趨于穩定。在近似線性范圍內，根據質量濃度（μg/ml）玐，清除率（%）玒的關系對各曲線進行線性擬合［21］。

圖46種樣品對DPPH自由基的清除曲線

2.4 樣品清除DPPH自由基的能力確定

根據6種樣品的清除曲線，確定各樣品的獻C50值（見表1）［22］。結合圖4和表1可以確定，6種樣品的清除能力的大小順序為：乙酸乙酯層>二氯甲烷層>蘿卜葉水提物>β補如藪>石油醚層>檸檬酸。

表16種樣品的線性方程、線性范圍、玆2及IC50值

樣品 樣品名稱 線性方程 線性范圍う蘥/ml 玆2 IC50值う蘥/ml

1 石油醚組分 玒=0.506 9X+27.600 1 1~50 0.927 4 48.6

2 二氯甲烷組分 Y=0.763 3X+32.587 3 1~40 0.893 6 18.0

3 乙酸乙酯組分 Y=1.110 0X+31.233 7 1~30 0.954 6 14.6

4 蘿卜葉水提物 Y=0.746 9X+26.638 8 1~40 0.946 5 28.9

5 β補如藪 Y=0.6031X+28.744 2 1~50 0.932 2 31.4

6 檸檬酸 Y=0.336 5X+20.888 5 1~40 0.996 2 -

3結論

試驗以DPPH自由基最大波長的確定試驗、DPPH自由

基穩定性考察為基礎，對蘿卜葉水提取物、水提物的不同極性部位萃取物、蘿卜中的脂肪油類化合物β補如藪冀行DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基清除能力試驗。結果表明，在乙醇體系、波長517 nm的條件下，測定6種樣品清除DPPH自由基的獻C50值，判斷其清除DPPH自由的活性大小順序為：乙酸乙酯層 >二氯甲烷層 >蘿卜葉水提物 >β補如藪>石油醚層>檸檬酸。由此得出結論，蘿卜具有較好的抗氧化能力。同時，對蘿卜抗氧化活性成分的跟蹤分離提供試驗依據。

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