杭州紅茄離體再生體系研究

肖文斐 裘劼人 來文國 張 雅 鄭桂珍 忻 雅 方獻(xiàn)平 王淑珍

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江杭州 310024）お

摘要

［目的］探索適用于浙江茄子品種“杭州紅茄”的高效離體再生的途徑和方法。［方法］以杭州紅茄的子葉、下胚軸和帶腋芽莖段為試材，研究了該品種從愈傷誘導(dǎo)、分化、增殖到生根壯苗過程的離體再生體系，對不同時期的培養(yǎng)基及激素配比進(jìn)行篩選比較。［結(jié)果］愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+6睟A 2.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L效果較好，分化的理想培養(yǎng)基為MS+ZT 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L, 而生根培養(yǎng)基以1/2MS+IAA 0.1 mg/L較適宜。［結(jié)論］該研究獲得了高效的杭州紅茄離體再生方法，為其基因工程的開展提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 茄子；杭州紅茄；外植體；組織培養(yǎng)；再生體系

中圖分類號 SB641.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06159-03

お

Study on the Efficient Regeneration System of 玈olanum melongena 獿．Cultivar “Hangzhou Hongqie” 玦n vitro

XIAO Wen瞗ei et al

(Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310024)

Abstract ［Objective］ To explore the efficient regeneration system of “Hangzhou Hongqie” which is the local cultivar of 玈olanum melongena 獿 in Zhejiang. ［Method］ With the cotyledon, hypoeotyls and stem segments of “Hangzhou Hongqie” as explants, the regeneration system in vitro including callus induction, differentiation, proliferation and the rooting process was studied. The optimum mediums and hormone ratio in different periods were obtained. ［Result］ The results showed that the suitable medium for the callus induction was MS+ ZT 1.0 mg/L+ IAA 0.1 mg/L, and the ideal medium for differentiation was MS +6睟A 2.5 mg/L+ IAA 0.2 mg/L. On the other hand, the medium of 1/2MS + IBA 0.3 mg/L was better than MS for rooting. ［Conclusion］ High efficient regeneration system of “Hangzhou Hongqie” was established, which provide technical support for its genetic engineering.

Key words玈olanum melongena 獿; Hangzhou Hongqie; Explant; Tissue culture; Regeneration system

お

作者簡介

肖文斐（1979-），女，湖南祁東人，助理研究員，博士，從事植物抗逆生物技術(shù)研究。

收稿日期 20140611

杭州紅茄是浙江省的常規(guī)茄子品種，其果實(shí)細(xì)長均勻，果皮紫紅鮮亮，皮薄肉白、質(zhì)糯，食味鮮美，是杭州十大名菜之一。但該品種株型較矮，長勢較弱，耐低溫、耐高溫能力較弱，制約其推廣與生產(chǎn)［1-2］。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其進(jìn)行品種改良是一條經(jīng)濟(jì)有效的途徑，建立高效的組織培養(yǎng)與植株再生體系是基因轉(zhuǎn)化的前提和必要條件。

目前國內(nèi)外有關(guān)茄子的組織培養(yǎng)和植株再生有過一些報道，主要從茄子的外植體器官再生、花粉(花藥)培養(yǎng)、原生質(zhì)體和小孢子培養(yǎng)等方面進(jìn)行了研究，雖然取得了一些成就，但尚存在著研究不夠系統(tǒng)和植株再生頻率不高的問題［2-6］。而茄子不同品種間的再生能力及對培養(yǎng)基的要求差異很大［5-6］。筆者以杭州紅茄為試材，探討影響其離體再生的主要因素，以期建立適用于杭州紅茄的高效再生體系，為其基因工程的開展奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試品種與外植體。供試品種為杭州紅茄，種子購于杭州市三葉種子公司。選取室內(nèi)培養(yǎng)的無菌幼苗的子葉、下胚軸及田間生長2個月左右的植株帶腋芽莖段為外植體供試。

1.1.2

供試培養(yǎng)基。根據(jù)不同試驗(yàn)階段和目的，以1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同植物生長調(diào)節(jié)激素和糖，配制相應(yīng)培養(yǎng)基。pH為5.8，瓊脂粉含量為7.5 g/L，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1

外植體的消毒處理。

1.2.1.1

室內(nèi)無菌苗外植體消毒。種子消毒及無菌苗培養(yǎng)。精選的種子自來水浸泡過夜，55 ℃水浴處理10 min，75%乙醇表面消毒60 s后，20%次氯酸鈉消毒20 min，滅菌水清洗4~5遍，接種于發(fā)芽培養(yǎng)基上（含0.8%瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基，不加蔗糖和激素），在25 ℃下每日光照16 h（光強(qiáng)為1 500 lx）的培養(yǎng)室內(nèi)培育出無菌籽苗。從種子萌動開始算起，選14~16 d苗齡的幼苗，分別取其子葉、下胚軸為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2.1.2

田間苗外植體的消毒。選取健康無病的杭州紅茄帶腋芽莖段，于自來水下沖洗30 min，再用蒸餾水沖洗3遍，在超凈臺上將其修成0.5~1.0 cm長莖段，75%乙醇表面消毒60 s后，0.1%HgCl2消毒8 min，滅菌水清洗4~5遍。

1.2.2

愈傷組織誘導(dǎo)。將子葉、下胚軸、帶腋芽莖段分別接種到含有不同激素組合的MS培養(yǎng)基上，篩選最適芽分化的培養(yǎng)基。取完全展開的子葉，去除葉尖及與葉片基部，切成1 cm×1 cm大小，在葉緣處橫切數(shù)條小口，正面向上平鋪接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。下胚軸分別切成0.5 cm左右的長段，豎直接在培養(yǎng)基上。帶腋芽莖段切成0.5~1.0 cm左右的長段，芽頭朝上接在培養(yǎng)基上。每個處理接種子葉50片、下胚軸30個、帶腋芽莖段20個。

1.2.3

分化培養(yǎng)。

將愈傷接種于附加不同激素組合的MS培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行分化培養(yǎng)。2周左右繼代1 次，4 周后統(tǒng)計結(jié)果。愈傷率(％)=(愈傷數(shù)/接種的外植體總數(shù)) ×100％；不定芽分化率(％)=(分化不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100％；不定芽分化系數(shù)=分化的不定芽總數(shù)/分化的外植體總數(shù)。

1.2.4

生根培養(yǎng)。當(dāng)芽長至2~3 cm 時，分化出2~4片真葉時將其切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，大約10 d后長出白色健壯的根系。

1.2.5

再生植株定植。

將生根的小苗室溫?zé)捗?~3 d后從培養(yǎng)基中取出，洗凈根上面的培養(yǎng)基，移栽到滅過菌的基質(zhì)中，2~3周后就可移到室外定植培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷形成的影響

采用MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對杭州紅茄3種類型外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)。將外植體接種后，5~7 d后有愈傷開始產(chǎn)生。從表1可以看出，1~8號培養(yǎng)基均可以誘導(dǎo)上述外植體產(chǎn)生愈傷，但愈傷的誘導(dǎo)率及生長狀態(tài)則有明顯的差異。其中，6睟A低濃度下誘導(dǎo)率稍低，愈傷較少，而隨著濃度的加大誘導(dǎo)率提高，愈傷較多；但高濃度（3 mg/L）時誘導(dǎo)的愈傷非常多，且容易玻璃化。0.2~2.0mg/L玉米素(ZT)的濃度均可以促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)，濃度增加愈傷化程度也相應(yīng)加大；而8號培養(yǎng)基雖然可以誘導(dǎo)愈傷的產(chǎn)生，但生長狀態(tài)較差，所以2,4睤在杭州紅茄的愈傷誘導(dǎo)中不適用。供試的3種外植體中，下胚軸和子葉的誘導(dǎo)率較高，其中6睟A的培養(yǎng)基中下胚軸誘導(dǎo)率高于子葉，而ZT對子葉的誘導(dǎo)效果更優(yōu)；腋芽莖段在各種培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率均低于前兩者。綜合考慮，2號培養(yǎng)基MS+6睟A 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L的誘導(dǎo)效果最佳（圖1），3種外植體的愈傷誘導(dǎo)率均在85%以上，愈傷生長狀態(tài)也均較好。

表1不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對不同外植體愈傷誘導(dǎo)的影響

編號 激素濃度mg/L

誘導(dǎo)率∥%

子葉 下胚軸 腋芽莖段

愈傷生長情況

子葉 下胚軸 腋芽莖段

1 6睟A 1.0+ IAA 0.1 74.2±5.3 81.8±5.1 71.5±6.9 量少，黃白色，松軟 量少，黃白色，松軟 量少，淺黃帶綠，松軟

2 6睟A 2.0+ IAA 0.1 94.9±3.2 96.2±4.3 85.3±6.1 量較多，綠色，芽點(diǎn)較多，較緊實(shí)，團(tuán)狀量較多，黃綠色，芽點(diǎn)較多，致密 量較多，綠色，芽點(diǎn)較多，塊狀

36睟A 3.0+ IAA 0.191.5±7.897.4±4.483.8±5.6大量愈傷，中間綠色周圍為半透明，塊狀，玻璃化量較多，發(fā)白，玻璃化大量愈傷，塊狀，半透明，玻璃化

4ZT 0.2+ IAA 0.179.3±7.576.9±5.870.1±9.3量中等，白中帶綠，團(tuán)狀量少，白中帶綠，致密量中等，綠色，芽點(diǎn)較多，團(tuán)狀

5ZT 0.5+ IAA 0.183.4±6.381.7±9.372.9±5.5量中等，淡黃綠色帶芽點(diǎn)，較緊實(shí)，團(tuán)狀量中等，白中帶綠，致密量較多，綠色帶芽點(diǎn)，較致密，團(tuán)狀

6ZT 1.0+ IAA 0.194.4±4.992.8±7.476.2±5.6量較多，淺綠色芽點(diǎn)較多，團(tuán)狀，較緊實(shí)量較多，白中帶綠色芽點(diǎn)，致密大量愈傷，塊狀，分化出許多綠色芽點(diǎn)

7ZT 2.0+ IAA 0.196.3±2.798.6±2.178.9±5.8大量愈傷，塊狀，中間綠色周圍半透明，芽點(diǎn)多大量愈傷，淡黃綠色，致密大量愈傷，塊狀，中間綠色周圍半透明，芽點(diǎn)多

8ZT 1.0+ 2,4睤 1.058.8±4.367.8±1.952.0±2.8黃褐色，松散，水漬狀褐化，松散，水漬狀褐化，松散，水漬狀

圖1 杭州紅茄子葉在2號培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷

表2 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對不同外植體不定芽分化的影響

培養(yǎng)基け嗪 激素濃度mg/L 不定芽分化率∥%

子葉 下胚軸 腋芽莖段

1 6睟A 1.0+IAA 0.1 12.3±2.5 31.3±6.1 8.7±2.1

2 6睟A 2.0+IAA 0.1 17.3±4.2 36.7±4.0 13.3±3.5

3 6睟A 3.0+IAA 0.1 8.7±1.5 13.3±2.5 3.7±2.5

4 ZT 0.2+IAA 0.1 76.0±6.6 66.7±6.1 46.3±4.7

5 ZT 0.5+IAA 0.1 67.3±4.7 48.3±3.1 33.7±1.5

6 ZT 1.0+IAA 0.1 54.0±3.6 34.5±4.6 31.7±5.0

7 ZT 2.0+IAA 0.1 38.0±2.6 30.2±2.0 23.2±2.6

8 ZT 1.0+2,4睤 1.0 0 0 0

2.2 分化培養(yǎng)基的篩選

從表2可以看出，試驗(yàn)中所用的6睟A和ZT與0.1mg/L IAA組合均能誘導(dǎo)杭州紅茄不定芽的分化。加入6睟A的培養(yǎng)基中2號培養(yǎng)基分化率最高；6睟A對3種類型外植體分化效果也不一樣，下胚軸的分化效率最高，子葉其次，而腋芽莖段最低。而ZT對杭州紅茄的分化效果明顯優(yōu)于6睟A，ZT濃度為0.2mg/L時最利于不定芽分化，隨著ZT濃度的增加，分化率下降。ZT更能促進(jìn)紅茄子葉外植體分化為不定芽，下胚軸分化率稍低，腋芽莖段最低；8號培養(yǎng)基沒有分化出芽。由此可見，MS+ZT 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L是篩選出的最佳分化培養(yǎng)基（圖2）。

圖2 杭州紅茄子葉在4號培養(yǎng)基上不定芽的分化

表3 不同培養(yǎng)基中的生根結(jié)果

培養(yǎng)基 生根率∥% 主根數(shù) 根長范圍∥cm

MS 65.1±14.2 3.4±0.2 0.1~0.9

MS+0.1 mg/L IAA 71.8±12.9 3.9±0.4 0.1~0.9

1/2MS 85.3±5.6 4.2±0.5 0.1~1.5

1/2MS+ 0.1 mg/L IAA96.1±3.5 5.6±0.3 0.2~1.7

圖3 1/2MS+0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基上不定芽的生根

2.3 生根及壯苗

試驗(yàn)中共采用4種培養(yǎng)基，結(jié)果顯示1/2MS生根效果明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基（表3），說明低離子濃度更利于杭州紅茄生根；而加入0.1mg/L IAA可以促進(jìn)根生長速度，提高生根率（圖3）。這與洪曉華等報道較為一致［7］。

3小結(jié)與討論

紅茄種子經(jīng)自來水浸泡過夜有利于種子吸脹，促進(jìn)發(fā)芽整齊一致。茄子種子上常附有果肉，在發(fā)芽培養(yǎng)時容易污染，不利于無菌苗的培養(yǎng)。55 ℃熱處理10 min，同時在培養(yǎng)基中不加蔗糖，則可以減少污染。種子發(fā)芽時用0.1%HgCl2滅菌效果較好，但對種子毒害大，嚴(yán)重影響種子萌發(fā)；而采用20%次氯酸鈉消毒20 min對種子發(fā)芽率影響較小，同時有相對較低的污染率。而在對田間苗外植體消毒時，次氯酸鈉效果很差，外植體污染率很高。0.1% HgCl2滅菌效果較好，消毒8 min時污染率較低，啟動率較高;但隨著滅菌時間的延長，外植體傷害大，啟動率低。

6睟A和ZT是茄科植物組織培養(yǎng)中常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，而在不同品種的茄子組培中最佳的誘導(dǎo)濃度不盡相

同［7-10］。而余波瀾等研究發(fā)現(xiàn)加入低濃度的IAA可以促進(jìn)

6睟A和ZT對芽分化的誘導(dǎo)率［8］，所以筆者在培養(yǎng)基中均加入了0.1mg/L IAA ，與不同濃度的6睟A或ZT組合應(yīng)用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1~3mg/L的6睟A與0.1mg/L IAA組合均能誘導(dǎo)杭州紅茄產(chǎn)生愈傷并分化出不定芽，但高濃度6睟A會導(dǎo)致外植體愈傷組織玻璃化，不利于分化；而ZT濃度較高時，芽愈傷化過于強(qiáng)烈，后期也難以正常分化。洪曉華等分析表明2,4睤可以誘導(dǎo)茄子不定芽的分化［7］，但該試驗(yàn)表明其在杭州紅茄的誘導(dǎo)分化中并不適用，這可能與品種差異有關(guān)。

不同外植體對不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導(dǎo)的反應(yīng)不同，分化效果也不一樣，這種現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)中較為常見［8，11］。該試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。6睟A能較好地誘導(dǎo)杭州紅茄下胚軸分化成苗，而ZT對子葉的分化效果較好，腋芽莖段則均為最低，可能是細(xì)胞分化程度不同導(dǎo)致其再生能力的差異。腋芽莖段在4號培養(yǎng)基中不定芽分化率也可以達(dá)46%，在無法取得子葉或下胚軸時，也可以考慮選用。而在選用植物激素時應(yīng)該考慮所應(yīng)用的外植體類型。

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