龍葵果提取物抗氧化活性測(cè)定及酚類(lèi)活性成分分析

騰飛 袁長(zhǎng)鵬 王萍

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)お

摘要

［目的］比較不同龍葵果提取物的抗氧化活性，同時(shí)測(cè)定其活性成分。［方法］用濃度60%乙醇浸提龍葵果，獲得粗提物，減壓蒸餾后分別用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿3種溶劑萃取，采用DPPH·、·OH，O2-·清除法對(duì)各提取物的抗氧化作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與濃度60%乙醇粗提物溶液進(jìn)行比較；分別測(cè)定4種龍葵果提取物中酚酸、黃酮、原花青素和花色苷的含量。［結(jié)果］濃度60%乙醇粗提物對(duì)DPPH·和·OH的清除效果最好，清除率分別為（68.45%±2.68%）和（49.12%±2.26%）；乙酸乙酯萃取物對(duì)O2-·的清除率最大為（79.64%±5.16%）。濃度60%乙醇粗提物中花色苷濃度為3.65 mg/ml，而乙酸乙酯萃取物中含有高濃度黃酮，濃度為3.42 mg/ml。［結(jié)論］龍葵果提取物中起主要抗氧化作用的是花色苷和黃酮。

關(guān)鍵詞 龍葵(玈olanum nigrum L.)；抗氧化；花色苷；黃酮

中圖分類(lèi)號(hào) SB567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06217-03

Study on Antioxidant Activity of Extracts from 玈olanum nigrum 獿. Berries and Analysis of the Active Ingredients

TENG Fei, WANG Ping et al

(Forestry School, Northeast Forestry Univer Sity, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract ［Objective］ The antioxidant activity of the different extracts from 玈olanum nigrum 獿. berries was compared and the active ingredients were determined. ［Method］The 玈olanum nigrum 獿. berries were extracted by 60% ethanol. Then 60% ethanol extracts were extracted by n瞓utanol, ethyl acetate and chloroform, respectively. DPPH free radicals, hydroxyl free radicals and superoxide radicals scavenging assays were investigated. In order to determine phenolic acid, flavonoids, proanthocyanidin and anthocyanins, the method of gallic acid, rutin colorimetric, hydrochloric acid瞯anillin and pH瞕ifferential spectrophotometry were applied in this work.［Results］ Ethanol extract had the highest DPPH free radicals and hydroxyl free radicals scavenging activity (scavenging activities of 68.45%±2.68% and 49.12±2.26%, respectively). The ethyl acetate extracts had the highest superoxide radicals scavenging activity (79.64%±5.16%). Ethyl acetate extract contained the highest concentration of flavonoids, while 60% ethanol extract contained the highest concentration of anthocyanins. ［Conclusion］This showed that anthocyanins and flavonoids had a positive effect against oxidative.

Key words 玈olanum nigrum 獿.; Antioxidant activity; Anthocyanins; Flavonoids

お

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金(31170510)。

作者簡(jiǎn)介

騰飛（1990-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：天然活性物質(zhì)提取分離。*通訊作者，碩士生導(dǎo)師，從事天然活性物質(zhì)研究。

收稿日期 20140603

龍葵(玈olanum nigrum.L)為茄科(Solanaceae)茄屬(玈olanum)一年生草本植物，是一種古老的東方藥用植物，被認(rèn)為有很多生物活性。龍葵全株高90~140 cm，暗綠色葉片，白色短梗小花。龍葵果未成熟時(shí)為綠色，成熟時(shí)為紫黑色［1］。目前關(guān)于龍葵提取物的抗氧化活性研究已有少量報(bào)道，賢景春［2-3］等采用超聲法提取少花龍葵多酚和黃酮，并且分別測(cè)定了龍葵多酚和黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力。Sun［4］等研究了龍葵中脂質(zhì)過(guò)氧化，抗氧化酶活性和游離脯氨酸和植物螯合肽的積累，并且與茄子進(jìn)行了對(duì)比。Jeong［5］等報(bào)道了一種從龍葵中純化的多肽對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明多肽預(yù)防DNA氧化損傷的機(jī)制是通過(guò)阻斷Fe2+和H2O2之間的反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，多肽對(duì)于化學(xué)預(yù)防的氧化癌變有積極的作用。筆者對(duì)不同龍葵果提取物進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，并且測(cè)定其中4種酚類(lèi)活性物質(zhì)含量，以期為龍葵的精深加工提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

研究對(duì)象。龍葵果，采自哈爾濱市郊，于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.1.2

主要儀器。722型分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精密儀器有限公司；離心機(jī)（TDL40B瞁）和高速搖床，購(gòu)自泰斯特有限公司；恒溫干燥箱（DHG9240），購(gòu)自一恒儀器；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和SHB3真空泵循環(huán)水系統(tǒng)，購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；PHS26數(shù)顯pH計(jì)，購(gòu)自上海精密試驗(yàn)儀器有限公司。

1.1.3

主要試劑。DPPH、2餐蜒酹睤埠頌?、没食租欋和露≠?gòu)自Sigma公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

龍葵果不同提取物的制備。參照文獻(xiàn)［6］的方法，獲得龍葵果粗提物。取龍葵果粗提物，平均分成4份，其中3份分別用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿萃取，回收溶劑并冷凍干燥成粉末，分別得到正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物和粗提物（60%乙醇提取物）。

1.2.2

龍葵果不同提取物清除DPPH·能力測(cè)定。參照參考文獻(xiàn)［7］的方法，不同龍葵果提取物配制成0.2~2.4 mg/ml濃度的樣品溶液。根據(jù)公式（1）計(jì)算清除率：

清除率(%)=［獳┛瞻轉(zhuǎn)-(A┭品-A┒哉摘)］/A┛瞻轉(zhuǎn)×100（1）

其中：獳┛瞻轉(zhuǎn)為不加樣品溶液，用60%乙醇代替；獳┒哉摘為不加DPPH溶液，用無(wú)水乙醇代替。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，得受試樣品濃度與DPPH·清除率關(guān)系曲線(xiàn)。

1.2.3

龍葵果提取物清除·OH能力測(cè)定。對(duì)·OH的清除作用采用生成硫代巴比妥酸法來(lái)測(cè)定，用2餐蜒酹睤埠頌親韉孜錚參考Suksomtip等方法［8］，利用公式（1）計(jì)算清除率。

1.2.4

龍葵果提取物清除O2-·能力測(cè)定。采用鄰苯三酚自氧化法。參照文獻(xiàn)［9］的方法利用公式（1）計(jì)算清除率。

1.2.5

龍葵果提取物中酚酸含量的測(cè)定。（1）線(xiàn)性關(guān)系的考察。酚酸的含量由沒(méi)食子酸表示。參照文獻(xiàn)［10］的方法，以沒(méi)食子酸的含量(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光值獳為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。（2）龍葵果提取物中酚酸含量的測(cè)定。精密移取一定濃度的龍葵果提取物溶液2.0 ml置于25 ml容量瓶中，加無(wú)水乙醇至5.0 ml，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法測(cè)定吸光值，根據(jù)所得的線(xiàn)性回歸方程計(jì)算樣品中的酚酸含量。

1.2.6

龍葵果提取物中黃酮含量的測(cè)定。（1）線(xiàn)性關(guān)系的考察。黃酮的含量以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。參照參考文獻(xiàn)［11］的方法，以蘆丁濃度獵(mg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光值獳為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。（2）龍葵果提取物中黃酮含量的測(cè)定。取一定濃度的龍葵果提取物2.0 ml于25 ml具塞試管，加濃度60%乙醇補(bǔ)足至10.0 ml，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得對(duì)應(yīng)濃度獵，可算得樣品的總黃酮含量。

1.2.7

龍葵果提取物中原花青素含量的測(cè)定。（1）線(xiàn)性關(guān)系的考察。樣品中原花青素含量使用香草醛-鹽酸法，參照參考文獻(xiàn)［12-13］的方法。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液吸光值獳，繪制原花青素濃度與吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。（2）取少量的不同龍葵果提取物配制成一定濃度的甲醇溶液，取2.0 ml至25 ml容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定吸光值，用所得的原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中原花青素含量。

1.2.8

龍葵果提取物中花色苷含量的測(cè)定。參照文獻(xiàn)［14］的方法并稍微改動(dòng)，配制一定濃度的龍葵果提取物溶液，分別移取配制好的龍葵果提取物溶液10.0 ml，用pH 1.0和4.5的緩沖溶液定容至100 ml。達(dá)平衡后（pH 1.0為50 min，pH 4.5為80 min）分別在510和700 nm處測(cè)定吸光值。

花色苷含量(mg/ml)=(獳/εL)×M璚×DF

（2）

式中：A為吸光度，A=(A510 nm pH1.0-獳700 nm pH1.0）-(獳510n m pH4.5-獳700 nm pH4.5)；ε為矢車(chē)菊3財(cái)咸煙擒盞南光系數(shù)，26 900；獶F為稀釋因子；M璚為矢車(chē)菊素3財(cái)咸煙擒盞姆腫恿浚449.2；獿為光程，1.0 cm。

2結(jié)果與分析

2.1龍葵果提取物抗氧化作用比較

2.1.1

龍葵果提取物清除DPPH·能力比較。圖1表明，龍葵果各提取物對(duì)DPPH·都表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，在濃度范圍內(nèi)呈良好的量效關(guān)系。整體而言，濃度60%乙醇提取物（粗提物）對(duì)DPPH·的清除能力高于其他3種萃取物，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.4 mg/ml時(shí)清除率達(dá)到最大（68.45%±2.68%）。清除能力大小依次為：60%乙醇粗提物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物，其獻(xiàn)C50分別為1.58、1.75、2.78和6.95 mg/ml。其中，當(dāng)濃度低于0.4 mg/ml時(shí)，正丁醇萃取物對(duì)DPPH·的清除率略高于粗提物和其他2種萃取物，但隨著濃度的不斷提高，60%乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除率迅速升高，當(dāng)濃度高于0.4 mg/ml時(shí)，乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除作用明顯優(yōu)于其他3種萃取物。可以看出，在低濃度時(shí)，除60%乙醇提取物外，隨著萃取劑極性的減弱，所得萃取物對(duì)DPPH·的清除能力逐漸減弱。

圖1龍葵果提取物對(duì)DPPH·的清除作用

2.1.2

龍葵果提取物清除·OH能力比較。圖2表明，龍葵果各提取物對(duì)·OH都表現(xiàn)出良好的清除能力，并在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。對(duì)·OH的清除能力大小依次為：粗提物>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>氯仿萃取物，其獻(xiàn)C50分別為2.78、7.30、28.55和94.01 mg/ml。但當(dāng)濃度低于0.6 mg/ml時(shí)，乙酸乙酯萃取物對(duì)·OH的清除作用略?xún)?yōu)于乙醇粗提物、正丁醇和氯仿萃取物。隨著濃度的提高，60%乙醇粗提物對(duì)·OH的清除作用明顯升高，當(dāng)濃度達(dá)到2.4 mg/ml時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到（49.12%±2.26%)，然而乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取物分別為(37.54%±1.53%)、(27.76%±1.83%)和(20.08%±1.18%)。

圖2 龍葵果提取物對(duì)·OH的清除作用

2.1.3

龍葵果提取物對(duì)O2-·清除能力比較。圖3表明，龍葵果各提取物均能明顯地清除O2-·，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈良好的量效關(guān)系。60%乙醇提取物（粗提物）和乙酸乙酯萃取物對(duì)O2-·的清除作用明顯高于其他2種萃取物。當(dāng)濃度為2.4 mg/ml時(shí)，乙酸乙酯萃取物和60%乙醇提取物對(duì)O2-·的清除作用達(dá)到（79.64%±5.16%）和（75.87%±5.2%）。而正丁醇萃取物對(duì)O2-·的清除作用明顯低于其他3種提取物，當(dāng)濃度達(dá)到1.6 mg/ml時(shí)，清除作用就達(dá)最大，為（37.54%±2.74%）。O2-·的清除能力大小依次為：粗提物=乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>正丁醇萃取物，其獻(xiàn)C50分別為1.07、1.07、2.35和6.25 mg/ml。

圖3 龍葵果提取物對(duì)O2- ·清除作用

2.2 龍葵果提取物酚類(lèi)活性成分分析

計(jì)算得酚酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：珁=0.048x+0.008，R2=0.998。黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=2.859x-0.010，R2=0.999。原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=0.143x-0.002，R2=0.999?；ㄉ蘸渴褂胮H示差法計(jì)算即可。

由表1可知，龍葵果各提取物中均含有酚酸，但含量差異較大，由多到少依次為60%乙醇提取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物。與提取劑極性強(qiáng)弱一致，表明酚酸易溶解在極性較強(qiáng)的溶劑中。龍葵果各提取物中均含有黃酮類(lèi)物質(zhì)，但其含量差異較大，由多到少依次為乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>60%乙醇萃取物>正丁醇萃取物，表明黃酮類(lèi)物質(zhì)易溶解在極性中等的溶劑中。正丁醇、乙酸乙酯、60%乙醇提取物中均含有原花青素類(lèi)物質(zhì)，但其含量差異較大，含量由多到少依次為乙酸乙酯萃取物>60%乙醇萃取物>正丁醇萃取物。而氯仿萃取物中不含原花青素，表明原花青素類(lèi)物質(zhì)易溶解在極性溶劑中，而在弱極性溶劑中不溶解。與參考文獻(xiàn)［15］對(duì)原花青素的描述“原花青素能很好地溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醇，不溶于苯、氯仿、石油醚、庚烷等”一致。

在4種提取物中，僅60%乙醇和正丁醇提取物中含有花色苷。其中，60%乙醇提取物中花色苷含量最高，為3.65 mg/ml，而乙酸乙酯和氯仿提取物中不含花色苷，表明花色苷為強(qiáng)極性物質(zhì)，易溶于強(qiáng)極性溶劑中。

お

表1 龍葵果提取物酚類(lèi)活性成分分析

樣品 酚酸う蘥/ml 黃酮う蘥/ml 原花青素う蘥/ml 花色苷う蘥/ml

正丁醇 7.02±0.23 290.15±1.15 2.25±0.11 841.67±3.22

乙酸乙酯 3.23±0.18 3 420.24±2.23 1.07±0.05 0

氯仿 0.91±0.09 1 230.16±2.24 0 0

60%乙醇 11.78±0.33 550.09±3.12 2.65±0.09 3 654.79±5.21

3結(jié)論與討論

龍葵果含有大量的抗氧化活性成分，這對(duì)工業(yè)有重要意義，因?yàn)檫@些活性物質(zhì)越來(lái)越多的被應(yīng)用于化妝品和藥品和食品等行業(yè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，這些活性物質(zhì)對(duì)DPPH·，·OH和O2-·有良好的清除能力。不同提取物所含有的成分不同，經(jīng)測(cè)定龍葵果提取物中含量最多的為花色苷（60%乙醇粗提物），其次是黃酮（乙酸乙酯萃取物），而酚酸和原花青素的含量則相對(duì)較少。這說(shuō)明龍葵果提取物中起主要抗氧化作用的是黃酮和花色苷。因此，龍葵果中含有的抗氧化劑作為功能性食品配料的發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

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