多環芳烴污染土壤微生物修復技術

孫萍 高永超 張強 黃玉杰 遲建國 邱維忠 王加寧

(1.山東省科學院生物研究所,山東濟南 250014；2．濟南大學化學化工學院,山東濟南 250022；3.山東省應用微生物重點實驗室,山東濟南 250014)お

摘要 微生物降解是環境中PAHs主要的降解方式。介紹了微生物的降解能力、PAHs生物可利用性、電子受體、營養物質、環境因子及植物聯合等對微生物降解PAHs的影響，并且對原位處理、異位處理的修復工藝進行了簡述。同時，指出今后的治理應重視污染源頭控制，完善酶制劑、聯合修復等有效的生物修復技術。

關鍵詞 生物修復；多環芳烴；污染土壤

中圖分類號 SB188文獻標識碼

A文章編號 0517-6611（2014）19-06220-04お

Research Advance on the Bioremediation of PAHs Contaminated Soil

SUN Ping, WANG Jia瞡ing et al(Biology Institute of Shandong Academy of Sciences, Jinan, Shandong 250014; School of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jinan, Jinan, Shandong 250022)

AbstractMicrobial degradation is the major degradation process of PAHs in the environment. Influence of microbes biodegradation property, bioavailability, electron acceptor, nutrient, environmental factors, and plant to biodegradation of PAHs and the remediation technology, including in瞫itu and off site remediation, were introduced. Controlling the pollution source, enzyme remediation and combined remediation were recommended in the remediation process.

Key wordsBioremediation; Polycyclic aromatic hydrocarbons; Contaminated soils

基金項目 國家高技術研究發展計劃(863)(2013AA06A210)；國家國際科技合作專項（2013DFR90540）。

ぷ髡嘸蚪 孫萍（1986-），女，山東濰坊人，碩士研究生，從事土壤污染微生物修復方面的研究。*通訊作者，研究員，博士，從事環境污染生物修復研究。

收稿日期 20140530

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指由2個或2個以上的苯環按一定順序排列組成的碳氫化合物，具有強烈致癌、致畸和致突變特性［1］。土壤中的PAHs 以4~6環的PAHs為主［2］?；剂系娜紵荘AHs的主要來源。由于人類對化石產品的不斷開發利用，PAHs持續向環境中排放，高溫過程形成的PAHs大都排放到大氣中，隨著大氣環流、大洋環流等循環而不斷擴散，空氣、土壤及水體甚至南極、高山冰川等都受到PAHs的污染。PAHs和其他固體顆粒物等結合在一起，通過干、濕沉降轉入湖泊、海洋，最終主要在沉積物、有機物質和生物體中累積，對人類健康和整個生態系統構成威脅［3］。

PAHs具有低水溶性、高親脂性以及化學穩定性的特點，環境中去除方式主要有揮發、光降解、生物積累、化學氧化、土壤吸附和微生物降解，而微生物降解是環境中PAHs最主要的去除方式。該過程在好氧、厭氧條件下都能進行［4］。人為強化修復可以加速PAHs在環境中的降解，方法主要有物理修復、化學修復和生物修復。生物修復是通過植物、微生物實現土壤污染物的轉移、消解，具有成本低、污染小、安全等優點，是修復工程中應用較廣泛且相對成熟的一種技術。

1 PAHs污染土壤生物修復的影響因素

1.1 生物對PAHs的降解性能

PAHs的生物降解是酶促反應過程。加氧酶對PAHs的酶促開環是PAHs生物降解的限速步驟。不同微生物中加氧酶的表達量及催化活性差異很大，因而降解PAHs的能力不同。篩選酶活性高、對PAHs降解能力強的微生物且對其進行馴化培養非常重要。

污染土壤中的PAHs降解菌經馴化、培養、富集，然后進行分離、鑒定及降解能力測試，得到降解能力較高的菌株［5］。篩選出的菌株經發酵、固定化而制備的微生物菌劑，構建了降解PAHs的土壤微環境，能提高降解菌在土壤中的存活率且可以提高PAHs的降解效率，降解效果明顯好于游離菌［6］。用現代分子生物學手段提高降解菌株PAHs降解相關酶的表達量或提高其催化活性、將不同的降解基因組裝到同一微生物體內提高其降解譜［7］、利用細胞融合技術將降解菌株與表面活性劑產生菌融合而得到高效降解的融合菌［8］等，都是獲得高效降解菌的有效手段，但應注意轉基因微生物在環境中的應用限制。污染土壤中多種PAHs共存且常與其他的污染物混合在一起，因此構建多功能的微生物菌群，有利于促進污染物的快速降解及徹底礦化［9］，有效地防止二次污染。

1.2 PAHs生物可利用性

PAHs的低水溶性導致其在土壤中的生物可利用性較差。表面活性劑可降低土-水界面張力、減少PAHs在土壤顆粒上的吸附而提高微生物對PAHs的吸收和降解［10］。在PAHs污染土壤中投加TW80（吐溫80），一段時間后土壤表面和空隙中布滿微生物菌落，投加TW80的處理培養30 d后PAHs降解率均明顯高于對照［11］。由此可知，TW80能提高PAHs的生物可利用性，并且提高其降解率。多數化學表面活性劑都具有生物毒性，大量使用后會引起土壤表面活性劑污染，而有些微生物在降解PAHs過程中能產生糖脂形式的生物表面活性劑［12］，乳化能力高于化學活性劑且不產生二次污染，因而比化學活性劑更安全、有效。為提高PAHs的降解效率，可利用現代生物技術賦予PAHs降解菌產表面活性劑的能力，或在修復過程中同時投加能產生表面活性劑的微生物。

1.3 電子受體

有機污染物在土壤環境中的降解是生物參與的氧化還原過程，在此過程中有機物為電子供體。微生物脫掉有機物上的電子，經電子傳遞鏈傳遞給電子受體，并且釋放能量供微生物生長代謝。如果電子受體缺失，則將會導致電子傳遞的終止而影響生物對有機污染物的氧化降解，因此土壤中電子受體的種類、濃度直接影響PAHs的降解速度。好氧和厭氧環境中微生物對PAHs的降解途徑不同［13］。好氧降解以O2作為電子受體，修復時可向污染土壤通氣供氧或添加供氧劑（如H2O2）；在厭氧條件下，以NO3-、NO2-、SO42-等含氧酸根作為電子受體進行反硝化、硫酸鹽還原發酵和產甲烷反應，實際應用時可添加此類電子受體［14］。好氧條件下的生物降解是PAHs的主要降解形式。因此，修復過程中通過強制通風的方式保證O2的供給是PAHs污染土壤修復過程中的重要措施。

1.4 營養物質

添加易于被微生物利用的C源，改善土壤環境中營養條件，可以促進PAHs降解微生物的增殖，提高微生物活性且促進對污染物的降解［15］。營養物質的比例平衡對微生物的生長繁殖非常重要，特別是用于合成細胞物質的大量元素，如比例失調會嚴重影響微生物細胞物質合成，降低微生物在環境中的密度，從而影響對污染物的分解效率。一般有機污染土壤中C元素含量較高，而N、P相對不足，人為調整土壤中有效碳、氮、磷的比例為100∶10∶1左右有利于有機污染物的降解［16］。在向PAHs污染土壤添加 N、P 等營養物時，需確定土壤中各種營養鹽的有效濃度。根據微生物種類、修復方式，通過實驗確定最佳的營養物濃度。微生物對污染土壤的修復是一個相對緩慢的過程，持續時間較長，因此在修復過程中要跟蹤檢測土壤中碳氮磷比例的變化，并進行補加，以防止因碳氮磷的比例改變而導致修復后期修復效果的下降。

1.5 環境因子

環境溫度、pH、土壤理化性質等因素也影響土壤中PAHs的降解。溫度對微生物降解 PAHs 的影響主要表現在它對微生物代謝活性、PAHs理化性質等方面的影響。不同微生物最適生長溫度、pH不同，多數微生物在20~40 ℃范圍內酶活性較高，對PAHs降解較快，而且在中性pH下活性較強，強酸或強堿條件下對PAHs的降解會受到明顯的抑制［17］。有些微生物能適應強酸或強堿極端環境［18］。篩選能適應極端環境的PAHs降解微生物或將相關基因克隆進PAHs降解菌可用于極端環境下的土壤修復。

2 修復工藝及應用

根據污染土壤的處置地點，微生物修復工藝可分為原位修復和異位修復。在實際修復過程中，可根據場地及污染物特征等因素選擇適合的修復技術。

2.1 原位修復 原位生物修復指不移動受污染的土壤，直接向污染的土壤中投加營養物質、供氧劑、電子受體、表面活性劑以及高效降解菌等，通過促進微生物的代謝活性來降解污染物的修復方式。原位修復技術不需要移動受污染土壤，不需要復雜的處理設備，具有操作簡便、成本低、對周圍環境影響小等優點，易于大面積推廣使用。按工藝技術特點進行分類，原位修復主要有生物通風法、投菌法、生物培養法、土耕法等。

2.1.1 生物通風法。生物通風法是在污染的土壤中打幾眼深井，安裝鼓風機和抽真空機，將空氣強行壓入土壤中，然后抽出，此過程中揮發性有機物隨之去除。通入空氣可以提高土壤中氧氣濃度，有利于提高微生物對PAHs的降解活性。在通入空氣時，可加入一定量的氨氣，為土壤中的降解菌提供所需要的氮源來促進降解菌的生長繁殖。這種通風技術適合多孔的土壤結構［19］，而地下水位高地區不宜使用。

2.1.2 投菌法。也稱生物強化法，就是直接向污染土壤中投加外源降解菌，同時提供這些降解菌生長繁殖所必需的營養物質。在自然條件下，降解PAHs的土著菌數量少、活性低。修復過程中將從污染環境中篩選馴化或利用基因工程獲得的高效降解菌培養后以較高的密度投加到污染土壤中，可增強修復效果。Juhasz等［20］用篩選出的菌株修復PAHs污染土壤，經修復后土壤中PAHs各組分含量均明顯降低，尤其是3環、4環、5環以及7環的PAHs降解效果顯著。由于PAHs常以多種組分共存，其生物降解過程涉及多種微生物和酶，導入單一的微生物難以對所有PAHs取得良好效果。因此，在實際應用中，可考慮投加多種高效降解菌組成的復合菌群，但外源菌應與土著菌有良好的相容性。

2.1.3 生物培養法。也稱生物刺激法。該方法是定期地向污染土壤中投加適量的菌體生長所需的營養物質以及電子受體，刺激土著PAHs降解微生物繁殖，并提供有利的降解環境以促進降解。土著菌經長期自然馴化，適應污染場地污染物濃度及種類，形成降解污染物的共生菌群，比外源添加的微生物具有更高的降解活性。Kaempfer等［21］向石油污染土壤中投加適量的N、P等營養元素和NO3-、O2及H2O2等電子受體，2 d后PAHs降解菌濃度顯著增加。生物刺激法可使降解速率提高2~3倍［22］，增強土著菌的活性。這是提高土壤中PAHs降解效率的有效途徑［23］。

2.1.4 土耕法。該方法是對污染土壤進行耕耙、施肥、灌溉，并且加入石灰，使得污染土壤充分與降解菌混合，為微生物盡可能提供一個良好的環境。該方法適用于土壤滲濾性較差、污染土層較淺的場地，由于操作方便、工藝簡單而處理成本較低。在利用土耕法修復石油污染土壤時，一年半后發現80%石油烴被降解，土耕法對土壤結構破壞較小、操作簡單、費用低，不足是污染物可能從土壤遷移且處理周期┙銑ぁ＊

2.1.5 植物修復。該方法是利用植物來降解或移除土壤中有機污染物的修復方式。機理包括植物對污染物的吸附、吸收、轉移、降解、固定、揮發等。植物與微生物組成復合體系中微生物和植物形成互惠共生體［23-25］。植物在吸收和礦化土壤中PAHs的同時，植物根際作用增加了PAHs降解菌的數量，而且植物分泌的有機物為微生物共代謝提供了基質底物，兩者共同作用可有效提高污染物的降解效率。玉米對多環芳烴芘污染土壤的修復結果顯示，植物吸收不是多環芳烴去除的主要機理。種植玉米增強了土壤中脫氫酶和脲酶等酶活性,促進了植物-根圈微生物體系對芘的生物降解［25］。

2.1.6 酶修復。PAHs污染土壤的微生物修復是微生物的酶促降解過程，提取微生物的胞內酶直接進行污染土壤修復，加速修復進程。相對于微生物修復，酶修復所受土壤環境因子的限制較小、對微生物間的競爭不敏感、即使在PAHs濃度很低時酶也有較高的催化降解活性。然而，從微生物胞內對酶的提取耗能較高，造成修復成本較高。同時，高效降解PAHs酶制劑的制備、酶修復過程的機理以及影響因子、最佳工藝等需進一步研究［26］。另外，酶制劑對PAHs等污染物的催化降解速率雖然較快，但在環境中的活性保留時間較短，因此在實際修復過程中，需要與微生物修復進行聯合。

2.2 異位修復

異位生物修復是將污染土壤轉挖出并移到另一個地方進行修復。該技術能有效縮短修復時間、控制修復效果，但成本高、生態環境易被破壞，廣泛應用受到一定的限制。異位修復工藝主要包括預制床法、生物反應器法、土壤堆肥法。

2.2.1 預制床法。在一平臺上鋪上砂石，把污染土壤以20 cm左右的厚度平鋪到預制床上，投入適量微生物生長繁殖所需要的營養物質、水等，定期翻耕補充氧氣。預制床設有濾液收集和控制排放系統，可使得污染土壤的遷移量最少。與同一區域的原位修復方法相比，預制床法對3環及以上的PAHs的降解效率明顯提高。有研究表明，當污染土壤中總石油烴含量為25.8~77.2 g/kg時，預制床法降解53 d，總石油烴降解去除率達60%左右，PAHs的去除率為32.86%~44.73%［27］。

2.2.2 生物反應器法。也稱為生物泥漿法，是將污染土壤移到反應器內，然后加入3~9倍的水，攪拌使其呈泥漿狀，加入營養物質、表面活性劑和電子受體等，通入空氣的同時劇烈攪拌，使得微生物與有機污染物充分接觸，降解一定時間后泥漿快速過濾脫水。生物反應器法降解PAHs以水相為處理介質，使污染土壤與微生物及其他添加物充分接觸混合均勻，且避免復雜多變的自然環境對修復的影響，PAHs的生物降解速度比其他生物處理過程更快。但是，該法的運行成本較高，僅適合小范圍的污染土壤修復。Robert等［28］在生物反應器中投入白腐真菌修復PAHs污染的土壤，處理36 d后相對分子量低的PAHs的降解率達到70％~100％，相對分子量高的PAHs的降解率為6％~50%。

2.2.3 土壤堆肥法。也叫生物堆制法、堆腐法，是將受污染的土壤挖掘出來，運輸到處理場地，加入干草、樹葉、木屑、麥稈、草炭、鋸屑及肥料等土壤調理劑以提供微生物生長的營養，并且用石灰調節其pH，為微生物的生長代謝提供良好的環境以促進污染物的降解。生物堆處理污染土壤時有較高的效率。毛麗華等［29］應用生物堆肥法修復油田污染土壤，40 d后原油去除率達45%。生物堆肥法可提高土壤的滲透性，改善土壤質量，縮短污染土壤的修復時間。

2.2.4 厭氧處理。在生物反應器處理時不通入空氣，可以創造一個相對厭氧的環境，利用厭氧降解菌進行厭氧處理，也可以取得良好的處理效果［30］，但是由于厭氧反應器的異位處理成本高，不適合大面積的土壤污染處理。土壤和沉積物中多為缺氧環境，為厭氧處理提供便利條件，只需補充厭氧微生物生長所需的有機質、電子受體，而無需向受污染土壤中補充氧氣，也無需經常翻耕，因此操作更方便、能耗更低且能防止污染物的揮發。在厭氧處理過程中，向土壤中添加硝酸鹽、硫酸鹽及產甲烷反應的有機質等厭氧反應的電子受體可以明顯促進PAHs的厭氧降解過程，特別是添加硫酸鹽的效果更顯著［31-32］。

3 研究展望

PAHs污染土壤的生物修復存在修復周期較長、降解過程中形成一些毒性更大的中間產物等問題，因此需要結合植物學、微生物學、環境化學和分子生物學等多學科領域知識建立高效的PAHs污染土壤的修復體系，強化微生物對PAHs的共代謝，加強修復過程的調控，探究外源高效降解菌與土著菌穩定共存的環境條件，并且構建高效修復菌群，進一步完善植物-微生物聯合修復技術，建立與其相適應的田地管理措施等，最終得到高效修復。

在完善修復工藝的同時，應注意以下方面。①減少PAHs的排放。我國工農業高速發展、化石燃料的消耗、柏油路大量鋪設等都造成PAHs的大量釋放、擴散。因此，應改變能源結構，減少煤炭、石油等的應用量，加強石化企業污染物的排放管理、石油制品的質量控制及燃燒后尾氣的治理等，從源頭杜絕污染物的外排。

②完善環境生態檢測系統，建立環境風險評價機制。當PAHs等污染物的排放大于生態環境的消除能力，環境中的污染物將會不斷地積累，生態系統破壞而導致不可恢復。因此，在嚴控污染排放的同時，應時刻警惕生態系統的不可修復性惡化。

③對于高濃度PAHs污染土壤，應采取物理、化學、生物聯合的修復方式，在高效、安全地去除污染物的同時，盡可能地降低修復成本，而且修復過程以盡可能地不破壞土壤的性質且生態安全為依據，保證土壤修復后的可利用性。在修復過程中，防止人為因素造成的PAHs及其降解中間產物在土壤環境中的滲漏及向大氣環境中的擴散，研究并完善厭氧修復工藝，同時利用酶制劑、化學催化劑等加速PAHs的┙到狻＊

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