離子液體對靶標生物和非靶標生物AChE的影響

2014-04-29 23:20:47盧嫚羅帥韓旭洋馬玲

安徽農業科學 2014年19期

盧嫚羅帥韓旭洋馬玲

（1.東北林業大學，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱師范大學，黑龍江哈爾濱 150025）お

摘要［目的］探究不同離子液體對靶標生物及非靶標生物體內酶活性的影響，明確其對靶標生物的毒殺作用及對非靶標生物的安全性。［方法］研究了3種離子液體對2種生物體內AChE活性的影響。［結果］溴化1慘一3布諄咪唑對斜紋夜蛾AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈抑制趨勢，獿C50濃度處理下呈先抑制后誘導的趨勢；對斑馬魚肝臟AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈始終抑制趨勢，在獿C50濃度處理下呈誘導-抑制-誘導的趨勢。溴化1捕』3布諄咪唑對斜紋夜蛾AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈先抑制后誘導的趨勢，在獿C50濃度處理下呈抑制趨勢；對斑馬魚肝臟AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈先誘導后抑制的趨勢，在獿C50濃度處理下呈抑制趨勢。1，2捕甲基咪唑對斜紋夜蛾AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈先抑制后誘導的趨勢，在獿C50濃度處理下呈先誘導后抑制的趨勢；對斑馬魚肝臟AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈抑制趨勢，在獿C50濃度處理下呈先抑制后誘導趨勢。［結論］ 3種離子液體在斑馬魚和斜紋夜蛾體內的積累對2種生物體內AChE的活性均有不同程度的影響，改變生物體內神經信號的傳導，導致生物體嚴重的行為改變、功能紊亂、癱瘓，從而產生毒害作用。

關鍵詞離子液體；AChE酶；斜紋夜蛾；斑馬魚

中圖分類號 SB433文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06250-03

お

Impact of Ionic Liquid on the AChE Enzymatic Activity of the Target Organisms and Non瞭arget Organisms

LU Man, MA Ling et al

(Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; Harbin Normal University, Harbin, Heilongjiang 150025)

Abstract［Objective］ To explore the impact on the acetylcholinesterase (AChE) enzymatic activity of different ionic liquids to target organisms and non瞭arget organisms. Clarify its toxic effect on the target organisms and non瞭arget organisms security. ［Method］ Effects of three kinds of ionic liquids on AChE enzymatic activity of both creatures body were studied. ［Result］ Impact on the AChE activity of 1睧thyl3瞞ethylimidazolium Bromide to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were from inhibited to induced trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were induced瞚nhibited瞚nduced trend;1睟utyl3瞞ethylimidazolium Bromide to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were from inhibited to induced trend, after 獿C50 concentrations were always inhibited trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were from induced to inhibited trend, after 獿C50 concentrations were always inhibited trend;1,2睤imethylimidazole to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were from inhibited to induced trend, after 獿C50 concentrations were from induced to inhibited trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were from inhibited to induced trend. ［Conclusion］ Have different levels of impact on three kinds of ionic liquids in 獴rachydanio rerio accumulating and 玃rodenia litura body of two kinds of AChE activity 玦n vivo, in vivo 玞hanges in the conduction of nerve signals, causing organisms severe behavioral changes, disorders, paralysis, resulting in toxic effects.

Key wordsIonic liquids; AChE; 玃rodenia litura; 獴rachydanio rerio

お

基金項目黑龍江省教育廳項目（12531217）。

作者簡介盧嫚（1982- ），女，黑龍江哈爾濱人，講師，碩士，從事森林病蟲害防治研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事森林保護研究。

收稿日期 20140603

離子液體是在室溫下為液體的離子化合物，近幾年來已被開發成一種新型綠色化學反應介質。目前，國內外對于離子液體的研究主要集中在合成、物化性質等領域。斜紋夜蛾（玃rodenia litura）屬鱗翅目夜蛾科又名蓮紋夜蛾，為農作物害蟲。我國除青海、新疆未明外，各省（自治區）都有發生。斜紋夜蛾易飼養且發生世代多［1］、抗氧化性強。

斑馬魚（獴rachydanio rerio），又名花條魚、藍條魚，原產地為孟加拉國、印度［2］。它擁有其他模式生物所無法比擬的優點，具有繁殖能力強、體外受精和發育、性成熟周期短、個體小、易養殖等諸多特點，成為最重要的模式動物之一［3］。斑馬魚已被廣泛應用于生物學各領域［4］，如發育生物學［5-8］、遺傳學［9-10］、腫瘤學［11］、毒理學［12-14］等。為此，筆者以斜紋夜蛾和斑馬魚為研究對象，研究了3種離子液體分別對二者體內乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的影響，以期為開發綠色、高效、安全的新型殺蟲劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試藥劑。

1，2捕甲基咪唑、溴化1慘一3布諄咪唑、溴化1捕』3布諄咪唑均購于上海江萊生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮、乙醇、考馬斯亮藍均購于黑龍江哈爾濱益世達化學試劑有限公司；碘化乙酰硫代膽堿購于Amresco公司；毒扁豆堿購于Sigma公司。

1.1.2供試生物。

1.1.2.1斜紋夜蛾。

將購于湖南農業大學的斜紋夜蛾成蟲飼養于養蟲室內，保持溫度（26±1）℃，相對濕度 60%~70%，光暗周期比為16∶8 h。待卵孵化后，以購買的飼料飼養幼蟲。選用蟲體大小一致、健康的4齡幼蟲作為試蟲。

1.1.2.2斑馬魚。

斑馬魚購于哈爾濱市大發市場。體長為（2.5±0.2）cm，體重為（0.24±0.05）g。供試用水為經過曝氣處理24 h以上的去氯自來水，pH為6.5~7.5。試驗前，將斑馬魚在供試用水中馴養7 d，自然死亡率小于1%，水溫在23~27 ℃，試驗前1 d停止喂食，在試驗期間不投放魚食，試驗用水與之前馴養供試用水一致，光暗周期比為12∶12 h。

1.2 方法

1.2.13種離子液體對斜紋夜蛾體內AChE活性的影響。

1.2.1.1試蟲處理。

根據3種離子液體對斜紋夜蛾4齡幼蟲的毒力測定結果［15］，以48 h的獿C50為基準，選取丙酮液（丙酮∶蒸餾水=2∶1，玍/V）配制成母液，之后再用蒸餾水稀釋成亞致死濃度獿C20，以相同溶劑作為對照組。將健康、大小一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲放入培養皿中，每個處理15頭，每個濃度3個重復，分別于觸殺處理 12、24、36、48 h后取樣，儲存于-20 ℃冰箱用于制備酶液。

1.2.1.2 酶液制備。

從每個處理組中隨機選取2頭斜紋夜蛾幼蟲，加1 ml經預冷過的提取液，置于冰浴過的玻璃勻漿器內充分勻漿，AchE離心參數為4 000 r/min，離心15 min，勻漿液為0.2 mol/L PBS（pH 7.5）。

1.2.1.3酶活性測定。

蛋白質含量測定參照Bradford［16］的考馬斯亮藍G250法。

參照Ellman等的方法［17］，略有改進。以1.5 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿作底物，AChE水解后產生乙酸和硫代膽堿，與1.0 mmol/L顯色劑DTNB生成黃色物質，用0.000 1 ﹎ol/L毒扁豆堿終止反應，測定玂D412值。

1.2.23種離子液體對斑馬魚體內AchE活性的影響。

1.2.2.1斑馬魚的處理。

根據羅帥等［18］對斑馬魚毒力測定的方法，通過試驗獲得3種離子液體對斑馬魚的毒力測定結果，以48 h的獿C50為基準，選取丙酮液（丙酮∶蒸餾水=2∶1，玍/V）配制成母液，之后再用蒸餾水稀釋成亞致死濃度獿C20，以相同溶劑作為對照組。將活潑、大小一致的斑馬魚投放至5 L玻璃缸中，每個處理15條斑馬魚，每個濃度設2個平行試驗，分別暴露1、7、14、21 d，然后分別于1、7、14、21 d后隨機挑取活的斑馬魚，儲存于-20 ℃冰箱用于制備┟敢骸＊

1.2.2.2 酶液制備。

從每個處理組中隨機選取2條斑馬魚，將肝臟解剖出魚體，加1 ml經預冷過的提取液，置于冰浴過的玻璃勻漿器內充分勻漿，置于4 ℃離心機內進行離心，上層清液即為酶液。AChE離心參數為4 000 r/min，離心15 min，勻漿液為0.2 mol/L PBS（pH 7.5）。

1.2.2.3 酶活性測定。方法同“ 1.2.1.3 ”。

1.2.3 數據處理。

用SPSS 18.0軟件統計同一時間處理下不同濃度3種離子液體對斜紋夜蛾和斑馬魚的AChE的活性，采用Duncans新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 3種離子液體對斜紋夜蛾AChE活性的影響

2.1.1溴化1慘一3布諄咪唑對斜紋夜蛾體內AChE活性的影響。

由圖1可知，在12、24、36和48 h時，經過獿C20濃度處理過的斜紋夜蛾體內AChE的活性均低于對照組，抑制作用顯著，其中12 h的抑制作用最大，抑制率為52.00%；在12、24、36 h時經過獿C50處理過的斜紋夜蛾體內AChE的活性均低于對照組，其中12和36 h時抑制作用顯著，12 h的抑制作用最大，抑制率為20.34%。48 h時活性高于對照組，為對照組的1.25倍，誘導作用顯著。